發(fā)布時(shí)間:2024-07-30 發(fā)布作者:上海通蔚生物
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種實(shí)用的分子生物學(xué)技術(shù),由KaryMullis于20世紀(jì)80年代開發(fā)。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù),通過(guò)變性、退火和延伸三個(gè)步驟循環(huán)進(jìn)行,實(shí)現(xiàn)DNA的指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。
它在科研中至關(guān)重要,不僅用于基因克隆與測(cè)序,還廣泛應(yīng)用于疾病診斷、遺傳病篩查、法醫(yī)學(xué)鑒定、生態(tài)學(xué)與進(jìn)化研究及基因表達(dá)分析等領(lǐng)域,是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究不可或缺的工具。相關(guān)閱讀:《PCR技術(shù)及其在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用》
在PCR實(shí)驗(yàn)中,準(zhǔn)確且高效的試劑和耗材對(duì)于成功進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)具有至關(guān)重要的影響。下面通蔚生物從PCR所需試劑和耗材詳細(xì)為大家細(xì)說(shuō)。
PCR試劑盒試劑
一般來(lái)說(shuō),一個(gè)完整的PCR反應(yīng)需要五種基本的PCR試劑;DNA/RNA模板、DNA聚合酶、引物(正向和反向)、脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)和PCR緩沖液。
PCR模板
選擇正確的PCR模板至關(guān)重要,因?yàn)椴煌?/span>PCR方法需要不同的模板。例如,在進(jìn)行RT-qPCR時(shí),需要RNA模板來(lái)產(chǎn)生互補(bǔ)DNA,而常規(guī)PCR則需要DNA模板。大量擁有高質(zhì)量的DNA/RNA模板也很重要,以幫助優(yōu)化PCR效率。因此,成功的PCR的第一步需要一個(gè)好的PCR模板制備試劑盒。
DNA聚合酶
所有PCR反應(yīng)都需要一種能在高溫下工作的DNA聚合酶,因?yàn)?/span>PCR的第一階段涉及在~90°C下分離DNA鏈。Taq聚合酶是一種從嗜熱菌Thermusaquaticus中分離出來(lái)的耐熱酶,是PCR中常用的DNA聚合酶。由于只有在如此高的溫度下才會(huì)發(fā)生激活,因此它可以減少PCR初始步驟中的非特異性擴(kuò)增。
引物
DNA合成的啟動(dòng)需要引物;短鏈核苷酸(DNA或RNA)與模板DNA互補(bǔ),并作為DNA/RNA聚合酶的DNA合成起點(diǎn)。將引物退火為單鏈DNA所需的溫度(50-65°C)低于變性步驟。退火步驟完成后,引物和模板DNA之間會(huì)形成氫鍵。
脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)
脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)是PCR的基本成分,因?yàn)樗鼈兪呛怂岬慕M成部分;如果沒(méi)有dNTP,DNA聚合酶就無(wú)法合成DNA。
PCR緩沖液
PCR緩沖液可確保PCR反應(yīng)在最佳條件下進(jìn)行。PCR緩沖液的主要成分包括Tris-HCl、氯化鉀(KCl)和氯化鎂(MgCl2)。Tris-HCl和KCl負(fù)責(zé)在PCR過(guò)程中維持穩(wěn)定的pH值,而鎂離子則作為DNA聚合酶的輔助因子,確保DNA合成功能正常。PCR緩沖液通常以10X濃度提供。相關(guān)閱讀:《》
PCR試劑盒耗材
PCR耗材是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中使用的必不可少的實(shí)驗(yàn)室用品,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是分子生物學(xué)中廣泛用于擴(kuò)增特定DNA序列的技術(shù)。這些耗材旨在確保PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確和高效執(zhí)行。
PCR管
這些是用于在PCR過(guò)程中盛放反應(yīng)混合物的小管,由薄壁聚丙烯制成。它們有不同的容量,例如0.2毫升或0.5毫升管。
PCR移液器及吸頭
用于精確量取和轉(zhuǎn)移液體試劑,包括不同規(guī)格的盒裝無(wú)菌刻度濾芯吸頭,如20μL、100μL、200μL、1mL等。
離心管和掌上離心機(jī)
離心管:如1.5mL離心管,用于樣品的分離、制備和存儲(chǔ);掌上離心機(jī):用于小量樣品的快速離心。
金屬浴或熱循環(huán)儀:提供PCR反應(yīng)所需的精確溫度控制。
電泳儀及配件:如電泳梳子、電泳槽、電泳導(dǎo)線、藍(lán)光燈等,用于PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和分離。
在PCR實(shí)驗(yàn)中,選擇選擇高質(zhì)量的試劑和耗材對(duì)于確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性至關(guān)重要。下文上海通蔚為大家詳細(xì)介紹PCR試劑及耗材的選擇
選擇PCR試劑盒的要點(diǎn)
明確實(shí)驗(yàn)需求:
首先,明確實(shí)驗(yàn)的具體需求,包括目標(biāo)基因的特異性、擴(kuò)增效率、靈敏度等。這將有助于篩選出最符合實(shí)驗(yàn)需求的試劑盒。
比較不同品牌和型號(hào):
市場(chǎng)上存在眾多品牌和型號(hào)的PCR試劑盒,因此需要進(jìn)行充分比較。重點(diǎn)考慮產(chǎn)品的性能參數(shù)(如特異性、靈敏度、擴(kuò)增效率等)、用戶評(píng)價(jià)、價(jià)格以及售后服務(wù)等因素。可以參考專業(yè)網(wǎng)站、學(xué)術(shù)期刊或同行推薦來(lái)選擇高質(zhì)量的產(chǎn)品。
考慮實(shí)驗(yàn)條件:
確保所選試劑盒與實(shí)驗(yàn)室的硬件條件(如PCR儀的型號(hào)、熱循環(huán)參數(shù)等)相匹配,以獲得最佳的實(shí)驗(yàn)效果。
檢查包裝和標(biāo)簽:
收到試劑盒后,檢查包裝是否完好、標(biāo)簽是否清晰。如有破損或模糊,應(yīng)及時(shí)聯(lián)系供應(yīng)商。
驗(yàn)證試劑的有效性:
按照說(shuō)明書要求,對(duì)試劑盒中的關(guān)鍵試劑(如引物、酶等)進(jìn)行有效性驗(yàn)證,以確保試劑質(zhì)量合格。
進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn):
在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),評(píng)估試劑盒的性能,如擴(kuò)增效率、特異性等,并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。
定期質(zhì)檢:
為確保試劑盒的質(zhì)量穩(wěn)定,建議定期對(duì)試劑盒進(jìn)行質(zhì)檢,包括關(guān)鍵試劑的活性、保存條件等。
圖1.上海通蔚PCR試劑盒
選擇PCR試劑耗材要點(diǎn)
材質(zhì)選擇:
PCR耗材一般為聚丙烯(PP)材質(zhì),因其具有生物學(xué)惰性、不易粘附生物分子、良好的化學(xué)耐性和溫度耐受性(可耐受121℃高溫及熱循環(huán)過(guò)程中的溫度變化)。
體積規(guī)格:
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的體積規(guī)格。常見的PCR管/板體積有0.5mL、0.2mL、0.1mL等。優(yōu)先選用低容管/板,因?yàn)樗鼈兡芴岣邿醾鲗?dǎo)率并降低蒸發(fā)。
蓋子類型:
平蓋適用于qPCR實(shí)驗(yàn),因?yàn)樗芴峁┚_的熒光信號(hào)傳遞且便于書寫標(biāo)記。凸蓋則適用于減少壓力引起的反應(yīng)管變形,但不適用于qPCR實(shí)驗(yàn)。
裙邊設(shè)計(jì):
對(duì)于96孔、384孔板等,裙邊設(shè)計(jì)可影響自動(dòng)化應(yīng)用及移液穩(wěn)定性。無(wú)裙邊板適用于大多數(shù)PCR儀但移液穩(wěn)定性不高;半裙邊板可適配標(biāo)簽或條碼并適用于自動(dòng)化應(yīng)用;全裙邊板則非常適用于自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)應(yīng)用且機(jī)械強(qiáng)度好。
管壁厚度:
管壁厚度應(yīng)均一以確保一致的熱傳導(dǎo)率。薄壁材質(zhì)可優(yōu)化熱傳遞、減少循環(huán)時(shí)間,但需注意其機(jī)械強(qiáng)度。
其他特性:
對(duì)于qPCR實(shí)驗(yàn),還需考慮耗材的透光性和避光性。白色PCR板通常優(yōu)于透明PCR板,因?yàn)樗芴峁└玫臒晒庑盘?hào)檢測(cè)效果。
問(wèn)題1:無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量低
答案:可能是由于模板DNA質(zhì)量差或濃度過(guò)低、引物設(shè)計(jì)不良、PCR反應(yīng)條件不佳或DNA聚合酶失活等原因?qū)е?。建議優(yōu)化引物設(shè)計(jì),調(diào)整PCR反應(yīng)條件,確保模板DNA質(zhì)量,并使用高質(zhì)量的酶。
問(wèn)題2:非特異性擴(kuò)增
答案:可能是由于引物設(shè)計(jì)不良、退火溫度過(guò)低、模板DNA質(zhì)量差或鎂離子濃度過(guò)高導(dǎo)致。建議優(yōu)化引物設(shè)計(jì),調(diào)整退火溫度,使用高質(zhì)量的模板DNA,并控制鎂離子濃度。
問(wèn)題3:假陽(yáng)性結(jié)果
答案:可能是由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的DNA污染或試劑污染導(dǎo)致。建議嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境,使用高質(zhì)量的試劑,并進(jìn)行空白對(duì)照。
問(wèn)題4:引物二聚體形成
答案:可能是由于引物設(shè)計(jì)不良或PCR反應(yīng)條件不佳導(dǎo)致。建議優(yōu)化引物設(shè)計(jì),調(diào)整退火溫度,并使用高質(zhì)量的酶。
問(wèn)題5:PCR反應(yīng)體系不穩(wěn)定
答案:可能是由于反應(yīng)體系的pH值不穩(wěn)定、反應(yīng)液的蒸發(fā)等原因?qū)е?。建議使用穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系,并確保反應(yīng)液的體積和濃度準(zhǔn)確。
技術(shù)進(jìn)步:PCR檢測(cè)技術(shù)不斷進(jìn)步,包括靈敏度、特異性、速度和自動(dòng)化程度的提高。這些進(jìn)步促成了新的PCR平臺(tái)的開發(fā),例如實(shí)時(shí)PCR(qPCR)、數(shù)字PCR(dPCR)和多重PCR,這些平臺(tái)增強(qiáng)了準(zhǔn)確和高效檢測(cè)的能力。
分子診斷需求不斷增長(zhǎng):對(duì)快速、準(zhǔn)確診斷工具的需求不斷增長(zhǎng),推動(dòng)了對(duì)PCR檢測(cè)技術(shù)的需求?;?/span>PCR的測(cè)試已廣泛用于檢測(cè)傳染病、遺傳疾病、癌癥生物標(biāo)志物和其他疾病。PCR能夠擴(kuò)增和檢測(cè)特定DNA或RNA序列,使其成為分子診斷中的重要工具。
即時(shí)檢測(cè)(POCT):即時(shí)PCR檢測(cè)的趨勢(shì)日益明顯,可實(shí)現(xiàn)快速的現(xiàn)場(chǎng)診斷。POCTPCR設(shè)備設(shè)計(jì)為便攜式、用戶友好型,能夠快速提供結(jié)果,這在偏遠(yuǎn)地區(qū)或資源有限的環(huán)境中尤其重要。
與新一代測(cè)序(NGS)的整合:PCR與NGS技術(shù)的整合促進(jìn)了遺傳物質(zhì)的高通量測(cè)序和分析?;?/span>PCR的靶標(biāo)富集方法(例如擴(kuò)增子測(cè)序和靶標(biāo)捕獲)已廣泛用于為NGS準(zhǔn)備DNA樣本,從而能夠更深入地了解遺傳變異及其在各種疾病中的影響。
在研究和藥物開發(fā)中的應(yīng)用日益增多:PCR檢測(cè)技術(shù)在基因表達(dá)分析、基因分型、突變檢測(cè)和傳染病研究等研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它還通過(guò)輔助靶標(biāo)識(shí)別、驗(yàn)證和藥物基因組學(xué)研究,在新療法和藥物發(fā)現(xiàn)的開發(fā)中發(fā)揮了重要作用。
市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)加?。?/span>PCR檢測(cè)技術(shù)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈,有多家知名和新興企業(yè)。各公司專注于開發(fā)創(chuàng)新的PCR平臺(tái)、擴(kuò)大產(chǎn)品組合并投資研發(fā)以獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。
上述為大家詳細(xì)介紹高質(zhì)量PCR試劑盒和耗材對(duì)科研實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。選擇高質(zhì)量的PCR試劑盒與耗材是確保分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。這些優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品具備高特異性、靈敏度及擴(kuò)增效率,能顯著降低實(shí)驗(yàn)失敗風(fēng)險(xiǎn),提升數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。在復(fù)雜和精密的實(shí)驗(yàn)中,如qPCR或高通量測(cè)序,它們更是不可或缺。高質(zhì)量的PCR試劑耗材不僅節(jié)省時(shí)間和成本,更是科研創(chuàng)新和深入探索生命科學(xué)奧秘的基石。因此,科研工作者應(yīng)高度重視并精心選擇這些關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)材料。