什么是標記抗體？一文帶您了解標記抗體及作用

  抗體標記，即在抗體上附加特定標簽以幫助檢測或分離/純化蛋白質，是一項重要技術。標記抗體對于免疫印跡、ELISA、流式細胞術、免疫組織化學(IHC)和免疫熒光(IF)等免疫檢測法至關重要。標記抗體還用于從復雜的蛋白質混合物中分離和純化單個蛋白質。與其他蛋白質一樣，抗體可以用小分子、放射性同位素、酶蛋白和熒光染料標記。

  傳統(tǒng)上，通常采用兩種不同的化學方法將抗體與小分子共價標記：

  該標記物與一級胺反應，用于標記抗體分子中的賴氨酸殘基

  抗體鏈內的二硫鍵被還原，然后與硫醇反應性標記物發(fā)生反應

  然而，已經(jīng)開發(fā)出新的方法，包括將標簽非共價添加到抗體的Fc部分，或將標簽共價添加到抗體重鏈的N連接聚糖上。

  所用標記類型取決于下游應用。上海通蔚生物將重點介紹抗體的非放射性標記及其用途。

圖1.直接夾心 ELISA，使用捕獲抗體和一抗

  生物素

  生物素是一種小分子（244.3Da），可與其結合伙伴親和素（存在于蛋清中）和鏈霉親和素（由細菌鏈霉菌產(chǎn)生）形成自然界中發(fā)現(xiàn)的最強的非共價相互作用之一。由于其大小，生物素很少會干擾抗體的活性，因此使其成為標記的良好選擇。

  生物素標記抗體用于Westerns、ELISA、流式細胞術、免疫熒光和免疫組織化學，當抗原難以檢測時，通常使用生物素標記抗體來提高檢測的靈敏度。通常，印跡或樣品與生物素標記抗體一起孵育，然后再與用酶或熒光染料標記的親和素或鏈霉親和素一起孵育?？贵w通常與多個生物素分子（3-6個分子）結合，從而產(chǎn)生擴增步驟，增強對較少抗原的檢測。雖然生物素標簽可以改善檢測，但它可能難以用于蛋白質的分離/純化，因為生物素和（鏈霉）親和素之間的強相互作用很難破壞。

  許多公司出售含有活性生物素分子的生物素化試劑盒，可輕松標記蛋白質。通常，抗體通過使用生物素類似物的N-羥基琥珀酰亞胺酯標記在賴氨酸的ε-氨基上。生物素使用至少6個原子的間隔臂附著在蛋白質上，以防止下游操作過程中的空間位阻。間隔臂的長度和組成可以變化，以優(yōu)化測定。

  酶報告基因

  傳統(tǒng)上，Western、ELISA和IHC中最常用的抗體標記是酶報告標記。酶標記比生物素大，但它們很少干擾抗體功能。最常用的酶標記是辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。

  要使用酶標記抗體，需要將樣品與酶特異性底物一起孵育，酶催化該底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物（顯色測定）或光（化學發(fā)光測定）。每種酶都有一組可用的底物和檢測方法。例如，HRP可以與二氨基聯(lián)苯胺反應產(chǎn)生棕色產(chǎn)物，或與魯米諾反應產(chǎn)生光。相反，AP可以與對硝基苯基磷酸鹽(pNPP)反應產(chǎn)生黃色產(chǎn)物（分光光度計可檢測到），或與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)和硝基藍四唑(NBT)反應產(chǎn)生紫色沉淀。顯色測定適用于蛋白質印跡、ELISA和IHC，而發(fā)光反應最常用于蛋白質印跡。許多具有不同靈敏度和輸出的底物可用于檢測，這使得酶報告基因成為最受歡迎的抗體標記之一。

  雖然報告酶也與賴氨酸的ε-氨基結合，但由于酶含有賴氨酸并具有多聚化的潛力，因此可以使用其他化學方法。酶標記的二抗在多家公司廣泛供應，而其他公司則銷售用于在實驗室中標記抗體的試劑盒。

  熒光標簽

  實驗室中熒光標記抗體的使用正在穩(wěn)步增加。由于熒光染料直接與抗體結合，因此檢測不需要酶/底物或結合相互作用。因此，檢測到的熒光信號量與樣品中的目標蛋白量成正比。熒光標記用于熒光蛋白質印跡分析、流式細胞術和IF，可用于高度定量分析。

  要檢測熒光標記，需要一種儀器，該儀器發(fā)射特定波長的光來激發(fā)熒光染料。然后，熒光染料會發(fā)出不同波長的信號。同一儀器包含適當?shù)臑V光片，用于檢測熒光染料的發(fā)射。流式細胞術需要使用流式細胞儀，而IF則使用熒光顯微鏡。Western印跡通常采用數(shù)字成像系統(tǒng)?？贵w可以用各種具有不同激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光染料進行標記。除了高度定量外，熒光標記還具有獨特的優(yōu)勢，即能夠通過使用具有不重疊發(fā)射光譜的染料來同時多路復用或檢測兩種或多種不同的目標蛋白。

對于標記，熒光標簽可以通過一級胺或硫醇基團共價連接到抗體上。熒光標記抗體可從許多公司購買，或者可以使用商業(yè)試劑盒在實驗室中標記抗體。