歡迎來(lái)到上海通蔚！

021-54845833/15800441009

品質(zhì)保證 · 通蔚試劑

當(dāng)前位置: 首頁(yè) > 科研產(chǎn)品 > PCR試劑盒 > 染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 > La Crosse病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

  • La Crosse病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

    規(guī)格：
    數(shù)量：

    購(gòu)買數(shù)量

    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號(hào) : TW38288
    • 應(yīng)用 : 僅供科研使用
    • 保存條件 : 低溫/避光保存
    • 貨期 : 現(xiàn)貨
    • 商品庫(kù)存：100
  • 商品詳情
  • 參考文獻(xiàn)
  • 說(shuō)明書下載
  • 商品評(píng)論0
  • 相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品及特點(diǎn)：
1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。
2. 根據(jù)La Crosse病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測(cè)，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá)到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
規(guī)格及成分：

編號(hào)

成分

規(guī)格

試劑一

2×qRT-PCR 緩沖液

500 μL（棕色管）

試劑二

10×qRT-PCR 酶混合液

100 μL（紅蓋）

試劑三

ROX 染料 I，50×

20 μL（棕色管）

試劑四

ROX 染料 II，50×

20 μL（棕色管）

試劑五

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1mL（黃蓋）

試劑六

La Crosse病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液

100 μL（白蓋）

試劑七

La Crosse病毒染料法 qRT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照 （1×10E8 /μL）

50 μL（黃蓋）

試劑八

沙核酸釋放劑（試用裝）

20 次（1mL，綠蓋）

試劑九

使用手冊(cè)

1 份

運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法： 
一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照：
以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例，由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
2. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
3. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：
5. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照梯度稀釋液中的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。
6. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)，其余不變。
8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：

成分

N+2個(gè)制備

所得樣品

qRT-PCR

陰性對(duì)照

qRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(2-7管)

2×qRT-PCR緩沖液

10μL

10μL

各10μL

La Crosse病毒染料法qRT-PCR引物混合物

2μL

2μL

各2μL

50×ROX (見注)

0.4μL

0.4μL

各0.4μL

樣品制備所得RNA

模板(來(lái)于第8步)

5.6μL

--

--

稀釋所得6個(gè)陽(yáng)性對(duì)照 (來(lái)于第6步)

--

--

各5.6μL2號(hào)樣到2號(hào) 管,3號(hào)樣到3號(hào)管

超純水

--

5.6μL

--

10×qRT-PCR酶混合液

2μL

2μL

2μL

注：需使用 ROX 染料 I 的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機(jī)型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機(jī)型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）。

過(guò)程

溫度

時(shí)間

RT（逆轉(zhuǎn)錄）

50℃

15-30 min

預(yù)變性

95℃

5 min

Qrt-PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)

95℃

15 sec

58℃

1 min,（采集FAM通道的熒光信號(hào)）

按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理：
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！