【通蔚生物】:ELISA實驗操作要點：樣本的收集及保存操作不當(dāng)會影響ELISA實驗結(jié)果

ELISA（酶聯(lián)免疫試驗）以其靈敏度較高、特異性好的特點已廣泛用于科研實驗及臨床，越來越多科研單位選擇用ELISA實驗方法完成研究課題。優(yōu)質(zhì)的試劑、好的儀器和正確的操作是保證ELISA試劑盒檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件，但樣本的收集及保存操作不當(dāng)也會影響ELISA實驗結(jié)果。樣本的收集跟保存聽上去貌似很簡單，但不乏有許多科研工作者因為樣本的收集跟保存沒做好而影響實驗結(jié)果。

下面針對樣本收集及保存通蔚生物提幾點建議：
1. 嚴(yán)重溶血，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性；
2. 混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈；如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)：
3. 標(biāo)本凝固不全，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；
4. 采血試管洗滌不徹底、反復(fù)使用易交叉污染：塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。

血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測，嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存；使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性；血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?/span>

被檢血清或血漿標(biāo)本，可用含保護性封阻劑（吐溫-20）或稱濕潤劑的緩沖液來稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì)，如1%牛血清白蛋白等來稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中進行孵育。此種被試標(biāo)本可作一系列稀釋度測定，也可用一個稀釋度測定。對于作某一個傳染病的診斷來說，最好先用一系列稀釋度作一批標(biāo)本測定，求出對診斷有意義的一個稀釋度（即測定劑量反應(yīng)曲線），然后用一個稀釋測定即可。最適稀釋度和孵育時間均需從實踐中摸索出來，對一般病原微生物所引起的傳染病的血清學(xué)診斷，以1：200稀釋度測定比較適當(dāng)，而試驗標(biāo)本的(即含抗體)作用時間一般為室溫或37℃ 1-2小時。但現(xiàn)在對有些標(biāo)本（如流腦抗原）測定時，僅用37℃ 5分鐘。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時間。