ELISA 技巧|做ELISA實(shí)驗(yàn)需要注意哪些問題？

常見問題

解決方案

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液不正確：使用錯(cuò)誤濃度的標(biāo)準(zhǔn)起始溶液可能會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)稀釋不足或過度稀釋，從而導(dǎo)致 OD 偏差并使標(biāo)準(zhǔn)曲線超出范圍。

仔細(xì)檢查標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度、稀釋計(jì)算和稀釋度。如果您要從凍干小瓶中重構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)品，請確保遵循廠家的說明。建議渦旋小瓶以確保完全重構(gòu)。

2.降解標(biāo)準(zhǔn)：舊的或儲存不當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)可能已經(jīng)降解，導(dǎo)致 OD 值低于未降解的標(biāo)準(zhǔn)。

驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)是否已正確配制并適當(dāng)存儲。

3.曲線不符合比例：有時(shí)，即使您認(rèn)為曲線繪制正確，您仍可能觀察到比平時(shí)更高或更低的 OD 值。這可能是由于檢測試劑批次不同等因素導(dǎo)致吸光度變化。

首次使用特定廠家的 ELISA 試劑盒時(shí)，請確保使用推薦的曲線擬合模型，通常是 4 或 5 參數(shù)邏輯曲線擬合模型 (4-PL 或 5-PL)。如有必要，請嘗試其他曲線擬合模型，如對數(shù)-對數(shù)。一致性是關(guān)鍵，因此更改曲線擬合模型可能會導(dǎo)致您的結(jié)果在檢測之間無法比較，尤其是在需要絕對值的情況下。

4.移液誤差：向板中添加樣品時(shí)可能會發(fā)生移液誤差，例如樣品量不正確或變異系數(shù) (CV) 過高。

為了最大限度地減少移液錯(cuò)誤，請確保移液器吸頭牢固連接，在試劑和樣品之間更換吸頭，消除孔或移液器吸頭中的氣泡，將試劑/樣品分配到孔的側(cè)面，并通過連續(xù)的抽吸/分配循環(huán)沖洗吸頭。

常見問題

解決方案

1.無樣品信號，但標(biāo)準(zhǔn)品和/或 QC 樣品良好

1.如果您的標(biāo)準(zhǔn)/校準(zhǔn)曲線和/或QC樣品顯示信號，但您的樣品沒有（如預(yù)期），則您的樣品可能有問題。可能出現(xiàn)以下幾種問題：

2.使用新的樣本基質(zhì)：并非所有ELISA都適用于所有樣本類型，使用不同樣本類型可能需要咨詢廠家或重新開發(fā)檢測方法。

3.稀釋度過高：樣品過度稀釋超過ELISA的靈敏度可能會導(dǎo)致信號丟失。

4.分析物低于檢測限：樣本中可能含有分析物不足，低于ELISA的檢測限。

5.降解樣本

零信號

有多種潛在原因可導(dǎo)致零信號產(chǎn)生：

1.孵育時(shí)間/溫度：驗(yàn)證孵育時(shí)間和溫度是否符合制廠家的說明要求，以避免影響檢測動力學(xué)。

2.捕獲/檢測抗體不足/不正確：仔細(xì)檢查抗體稀釋度，特別是內(nèi)部制備的試劑，并確保正確訂購廠家提供的即用型試劑。

3.添加的捕獲/檢測試劑不足：確保向板中添加了正確量的試劑。

4.讀取器波長：確認(rèn)您的平板讀取器上的波長設(shè)置正確，特別是在使用需要視覺停止的底物時(shí)。

5.底物溶液：使用正確的底物并檢查儲備溶液的有效期。

6.洗板：避免過度劇烈或長時(shí)間洗板，因?yàn)檫@可能會洗掉分析物或試劑。

7.干燥孔：防止孔變干，以避免出現(xiàn)不可預(yù)測的ELISA問題。

常見問題

解決方案

移液誤差

雖然通常歸因于移液誤差，但高 CV 也可能由樣品制備、試劑處理和清洗步驟中的錯(cuò)誤造成。確保稀釋樣品混合正確，以避免重復(fù)樣品之間存在差異。

樣品準(zhǔn)備

將稀釋樣品加入板中之前，大力混合或用移液器吸出稀釋樣品，以避免分析物分布不一致。

試劑準(zhǔn)備

試劑（如捕獲抗體或檢測抗體）混合不當(dāng)可能會導(dǎo)致不同孔中的試劑水平不同，從而增加 CV。

洗板

確保徹底、一致地洗板，以防止板上殘留基質(zhì)成分，導(dǎo)致背景信號增加。

孔內(nèi)氣泡

移液時(shí)盡量減少氣泡，因?yàn)闅馀輹蓴_分析物或試劑。讀取板前應(yīng)消除所有可見氣泡。

邊緣效應(yīng)

注意邊緣效應(yīng)，這可能是由于板上的溫度差異造成的?？刂茰囟炔⒋_保適當(dāng)?shù)脑噭┗旌峡梢跃徑獯藛栴}。