ELISA樣本處理？不同類型ELISA樣本處理方法比較

  ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是一種用于量化樣本中目標(biāo)靶標(biāo)的技術(shù)。常見樣本包括血液（血清和血漿）、組織勻漿、細(xì)胞裂解物和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。ELISA獲得的結(jié)果可能受到樣本的收集、處理和儲(chǔ)存方式的影響。本問為您介紹ELISA樣本處理方法。

  目錄：

  血液

  組織勻漿

  細(xì)胞裂解物

  細(xì)胞培養(yǎng)上清液

  一、血液

  全血樣本含有多種成分。主要成分是血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板）和血液的液體成分。全血可以離心，使血細(xì)胞與血液分離。根據(jù)血液的制備方式，所得液體將是血清或血漿。

  血清

  血清是血液中不含血細(xì)胞或凝血因子的成分。它本質(zhì)上與血漿相同，但不含纖維蛋白原。凝固的血液會(huì)產(chǎn)生不含纖維蛋白原的血清，但可能殘留一些凝血因子。

  制備方案：

  1.使用血清分離管收集血清，在室溫下靜置1-2小時(shí)或在4°C下靜置過夜。

  注意：血液樣本靜置后會(huì)自然凝結(jié)；溫度越低，凝結(jié)過程越慢。

  2.以1000×g的速度離心20分鐘。

  3.將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一個(gè)月）或-80°C（最多兩個(gè)月）下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。

  血漿

  血漿是血液的一種成分，構(gòu)成血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板）周圍的細(xì)胞外基質(zhì)。抗凝（未凝固）的血液會(huì)產(chǎn)生血漿，其中包括纖維蛋白原和凝血因子。如果目標(biāo)分析物是凝血因子，建議使用血漿作為樣品類型，而不是血清。

  血漿樣本需要抗凝?？鼓齽┑倪x擇取決于目標(biāo)分析物。通常使用2%EDTA、1%肝素或3.8%檸檬酸鈉。應(yīng)避免溶血，因?yàn)檫@會(huì)釋放蛋白酶，從而導(dǎo)致樣本中存在的目標(biāo)分析物降解。高脂質(zhì)濃度會(huì)導(dǎo)致溶血，因此也應(yīng)避免。

  制備方案：

  1.將血漿收集到含有所需抗凝劑的試管中。

  2.收集后30分鐘內(nèi)，在2-8°C下以1000×g離心15分鐘。

  3.將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一個(gè)月）或-80°C（最多兩個(gè)月）下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。

  檸檬酸鈉

  血液中的Ca2+通過鈣依賴性凝血途徑促進(jìn)凝血。檸檬酸鈉螯合游離Ca2+離子，抑制這些途徑，從而防止凝血。

  優(yōu)點(diǎn)：適用于大多數(shù)情況，不影響凝血因子。

  缺點(diǎn)：抗凝作用弱，溶解性差。

  建議用法：檸檬酸鈉（109mmol/L）：血液比例為1：9；或檸檬酸鈉（106mmol/L）：血液比例為1：4。

  乙二胺四乙酸

  血液中的Ca2+通過鈣依賴性凝血途徑促進(jìn)凝血。乙二胺四乙酸(EDTA)螯合游離的Ca2+離子，使其不再處于游離狀態(tài)，從而阻止凝血。

  優(yōu)點(diǎn)：適用于大多數(shù)情況，不影響紅細(xì)胞或白細(xì)胞。

  缺點(diǎn)：影響血小板聚集，不適合檢測(cè)凝血或血小板因子。

  建議使用方法：EDTA（15g/L）：血液比例為1:10

  肝素

  抗凝血酶III是一種抑制凝血途徑中多種酶（主要是絲氨酸蛋白酶）的蛋白質(zhì)。肝素與抗凝血酶III結(jié)合，將其激活，導(dǎo)致抗凝血酶III活性增加，從而增強(qiáng)抗凝血作用。

  優(yōu)點(diǎn)：抗凝效果強(qiáng)，不改變血細(xì)胞體積，高溫下穩(wěn)定，不易溶血。

  缺點(diǎn)：引起白細(xì)胞聚集，抗凝效果短暫。

  建議用法：肝素（1g/L）：血液比例為1:10。

  二、組織勻漿

  組織勻漿的實(shí)驗(yàn)方案取決于用作樣本的確切組織。可能需要添加蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)分析物降解。一些組織樣本（如肝臟、腎臟、腦組織）可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，因?yàn)閮?nèi)源性生物素會(huì)與親和素和鏈霉親和素相互作用。

  制備方案：

  1.用冰冷的PBS沖洗組織以去除多余的血液。在均質(zhì)化之前稱量組織。

  2.將組織切碎，在冰上用組織勻漿器在PBS中勻漿，并對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行超聲處理。

  3.以5000×g的速度離心5分鐘，以去除所有沉淀物。

  4.將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一個(gè)月）或-80°C（最多兩個(gè)月）下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。

  三、細(xì)胞裂解物

  細(xì)胞必須先裂解才能進(jìn)行ELISA檢測(cè)。細(xì)胞裂解可通過物理方法（如超聲波或凍融循環(huán)）或化學(xué)方法（如RIPA、TritonX-100、NP-40、SDS、脫氧膽酸鈉、β-巰基乙醇、DTT、尿素）誘導(dǎo)。通常，物理方法優(yōu)于化學(xué)方法，因?yàn)榛瘜W(xué)洗滌劑會(huì)影響ELISA獲得的結(jié)果。建議使用1%濃度的TritonX-100和1%NP-40，因?yàn)檫@足以裂解細(xì)胞，同時(shí)對(duì)ELISA吸光度值沒有或幾乎沒有明顯影響。

  建議方案：

  1.用胰蛋白酶分離貼壁細(xì)胞，然后離心并收集上清液。對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心并收集上清液。

  2.用冰冷的PBS清洗細(xì)胞三次，然后用PBS重新懸浮。

  3.用超聲波裂解細(xì)胞四次?；蛘?，將樣品凍融（-20°C至室溫）三次。

  5.在2-8°C下以1500×g離心10分鐘，以去除任何細(xì)胞碎片。

  將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一個(gè)月）或-80°C（最多兩個(gè)月）下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。

  四、細(xì)胞培養(yǎng)上清液

  如果目標(biāo)分析物是分泌蛋白，則建議使用細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為樣品類型。

  制備方案：

  1.以1000×g的速度離心20分鐘，以去除所有沉淀物。

  2.將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中并立即分析或儲(chǔ)存在4°C（最多一周）、-20°C（最多一個(gè)月）或-80°C（最多兩個(gè)月）下。避免反復(fù)凍融。在進(jìn)行分析前將樣品恢復(fù)至室溫。

  上述為大家介紹了常見ELISA樣本處理，正確的樣本處理有助于提高ELISA實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。除了常見的樣本制備之外，根據(jù)目標(biāo)分析物，可以測(cè)試其他樣本，例如皮膚、尿液、糞便、支氣管肺泡灌洗液、胸膜液、唾液、腦脊液等。本篇篇幅有限，下次詳細(xì)介紹。