ELISA實(shí)驗(yàn)原理詳解

  ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)）是一種利用特異性抗體（抗原）反應(yīng)將目標(biāo)抗原（抗體）結(jié)合在固相載體上，并利用酶標(biāo)記的抗體（或抗原）進(jìn)行檢測，并根據(jù)顯色反應(yīng)的強(qiáng)弱來定量樣品中目標(biāo)物質(zhì)的含量。它是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法，目前廣泛應(yīng)用生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多種研究領(lǐng)域。

  ELISA實(shí)驗(yàn)原理

  在ELISA中，將已知的抗原或抗體結(jié)合在固相載體表面，然后利用酶標(biāo)記（偶聯(lián)）的抗體或抗原與之孵育，測量加入底物后形成的產(chǎn)物的光吸收并將其轉(zhuǎn)換為數(shù)值來進(jìn)行定性和定量分析。如果對(duì)定性和定量分析不是很理解，可以參考這篇文章《ELISA檢測試劑盒：定性與定量分析的優(yōu)勢比較》。根據(jù)抗原抗體結(jié)合，該檢測方法分為直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA法和競爭ELISA法等。

  直接ELISA法

  原理：將目標(biāo)蛋白（或目標(biāo)抗體）固定在酶標(biāo)板上，與針對(duì)該目標(biāo)蛋白的酶標(biāo)記抗體（或針對(duì)該目標(biāo)抗體的特異性抗原）一起孵育，洗滌后，測量微孔板孔結(jié)合酶的活性。

  間接ELISA法

  原理：將目標(biāo)蛋白（或目標(biāo)抗體）固定在酶標(biāo)板上，隨后分兩步來進(jìn)行檢測，先加入檢測抗體或抗原進(jìn)行特異性結(jié)合。其次再加入酶標(biāo)二抗檢測并利用底物顯色。

  夾心ELISA法

  原理：將針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體固定在酶標(biāo)板，先與目標(biāo)蛋白孵育，然后與另一種用酶標(biāo)記的目標(biāo)蛋白特異性抗體孵育。清洗后，測量微孔板孔結(jié)合酶的活性。

  競爭ELISA法

  原理：將針對(duì)特定目的蛋白的抗體固定在酶標(biāo)板，與含有目的蛋白的樣品以及已知量的酶標(biāo)記的目的蛋白一起孵育，反應(yīng)結(jié)束后，測量微孔板孔結(jié)合酶的活性。

  當(dāng)樣品中的抗原水平較高時(shí)，抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原水平較低，顏色較淺。相反，當(dāng)抗原水平較低時(shí)，抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原水平較高，顏色較深。

  上述是ELISA實(shí)驗(yàn)原理步介紹，上述4種ELISA法檢測原理有區(qū)別，在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)候，結(jié)合自己檢測目標(biāo)及實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。如果想了解更多ELISA法區(qū)別，本篇幅有限，可以參考這篇文章《酶聯(lián)免疫試劑盒常見5種實(shí)驗(yàn)檢測方法》。接下來以夾心法為列，詳細(xì)介紹下ELISA實(shí)驗(yàn)步驟。

  1、試劑和設(shè)備的準(zhǔn)備

  2、抗體的固定化

  將稀釋后的抗體加入96孔ELISA板的每個(gè)孔中，密封板以防止蒸發(fā)，并在4°C下孵育15-18小時(shí)以固定抗體。

  3、洗滌

  除去稀釋的抗體，用洗滌液洗滌3次。

  4、封閉

  向每個(gè)孔中添加封閉緩沖液，并讓其在37°C下孵育1小時(shí)，以減少目標(biāo)蛋白與孔的非特異性結(jié)合。

  5、洗滌

  除去封閉緩沖液，用洗滌液洗滌3次。

  6、樣品添加

  用樣品稀釋緩沖液稀釋樣品，并將每個(gè)樣品100μL添加到每個(gè)孔中。為制作校準(zhǔn)曲線，在同一板上準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品的一系列稀釋液。將其在37°C下孵育1小時(shí)。

  7、洗滌

  取出樣品，用洗滌液洗滌5次。

  8、檢測抗體的添加

  用樣品稀釋緩沖液稀釋檢測抗體，每孔加入100μL，

  37°C孵育1小時(shí)。

  9、洗滌

  反應(yīng)結(jié)束后，去除檢測抗體，用洗滌液洗滌5次。

  10、酶標(biāo)二抗的添加

  用樣品稀釋緩沖液稀釋酶標(biāo)二抗，每孔加入100μL，

  37℃孵育1小時(shí)。

  11、洗滌

  反應(yīng)結(jié)束后，除去二抗，用洗滌液洗滌5次。

  12、添加底物溶液。

  孵育直至顏色顯現(xiàn)。

  13、用讀板器測量450nm處的吸收率。