ELISA 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題及解決

  上篇文章為大家介紹了《ELISA是什么？它能檢測(cè)出什么？》。相信大家對(duì)ELISA應(yīng)用有所了解，不過(guò)在ELISA實(shí)驗(yàn)中難免會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，今天為大家介紹一下ELISA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的問(wèn)題以及對(duì)遇到問(wèn)題的解決辦法。

  ELISA原理之前文章中有闡述，這里再簡(jiǎn)要概述一下，了解ELISA原理有助于應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)遇到問(wèn)題。

  Elisa的原理

  通過(guò)抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗原也可以是抗體。

  在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化水解或氧化還原反應(yīng)而成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

  所生成有色產(chǎn)物的顏色深淺與欲測(cè)的抗原(抗體)含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)加以測(cè)定。其方法簡(jiǎn)單，方便迅速，特異性強(qiáng)。

  Elisa對(duì)照

  每次進(jìn)行ELISA時(shí)都應(yīng)進(jìn)行對(duì)照，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。常見(jiàn)的對(duì)照包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照、空白孔和質(zhì)量控制樣品。陽(yáng)性對(duì)照含有已知量的目標(biāo)抗原，而陰性對(duì)照則不含?？瞻卓撞缓瑯悠坊蛟噭?，用于測(cè)量背景信號(hào)。質(zhì)量控制樣品用于驗(yàn)證檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度。

  Elisa問(wèn)題和解決方案

  空白（B）

  ELISA中使用空白對(duì)照孔（B）是為了控制板本身的變異，這些孔不接觸任何樣本或檢測(cè)抗體。如果空白孔的OD值升高，可能表明洗板存在問(wèn)題，需要進(jìn)一步調(diào)查。常見(jiàn)原因包括洗板機(jī)故障、底物過(guò)量或其他因素。

  零濃度(ZC)

  ELISA中的零濃度對(duì)照(ZC)與空白對(duì)照(B)類似，但包括檢測(cè)中使用的所有緩沖液和試劑，但不包含目標(biāo)抗原。它可以幫助確定檢測(cè)的背景信號(hào)，對(duì)于計(jì)算真正的檢測(cè)限(LOD)至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過(guò)程中，ZC的OD值應(yīng)該保持穩(wěn)定，如果出現(xiàn)明顯變化，需要調(diào)查原因，例如洗板機(jī)故障、試劑問(wèn)題或其他因素。定期檢查ZC對(duì)照的OD值，并及時(shí)排查問(wèn)題，可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

  非特異性結(jié)合(NSB)

  NSB對(duì)照是ELISA中的另一種對(duì)照，它可以評(píng)估檢測(cè)抗體（標(biāo)記抗體）對(duì)總OD信號(hào)的非特異性貢獻(xiàn)。在NSB對(duì)照中，通常不添加特異性抗原或樣品，而是僅將ELISA板與標(biāo)記抗體和必要的緩沖液（如阻斷緩沖液）孵育。有時(shí)，還會(huì)采用增強(qiáng)的洗滌步驟來(lái)進(jìn)一步減少非特異性結(jié)合。通過(guò)這種方式，NSB對(duì)照能夠區(qū)分由特異性抗原-抗體結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)與由非特異性因素（如標(biāo)記抗體與ELISA板表面的非特異性吸附）產(chǎn)生的背景信號(hào)，從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。NSB對(duì)照的預(yù)期OD值應(yīng)該略高于空白對(duì)照(B)孔，但低于零濃度對(duì)照(ZC)孔。如果NSB孔的OD值明顯高于預(yù)期，則可能表明標(biāo)記抗體存在非特異性結(jié)合、封閉不充分或其他因素。正確的試劑制備和輸送對(duì)NSB對(duì)照和整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

  最大結(jié)合(MaxBinding)對(duì)照

  最大結(jié)合對(duì)照用于估計(jì)檢測(cè)所能產(chǎn)生的最大信號(hào)。它通過(guò)將過(guò)量的抗原或標(biāo)準(zhǔn)品加入到微孔板中，確保所有捕獲抗體都被結(jié)合，從而確定信號(hào)的上限。最大結(jié)合對(duì)照對(duì)于計(jì)算樣本的結(jié)合百分比、識(shí)別樣本、底物或檢測(cè)抗體的問(wèn)題至關(guān)重要。

  通蔚建議

  Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致或不準(zhǔn)確的結(jié)果可能是由于各種因素造成的，例如試劑使用不當(dāng)、孵育不均勻、移液技術(shù)不正確、交叉污染以及ELISA試劑盒質(zhì)量低劣。為了確保ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性，建議注意以下幾個(gè)方面：

  1.試劑管理:

  使用新鮮、適當(dāng)稀釋的試劑，并在移液到板上之前充分混合。

  選擇黑值低、吸附性好的優(yōu)質(zhì)ELISA試劑盒。

  定期校準(zhǔn)儀器，并使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。

  2.操作步驟:

  孵育期間使用板密封劑，并避光孵育底物。

  使用移液器時(shí)，每次移液前都應(yīng)更換槍頭，并且不要讓移液器接觸孔底，以避免交叉污染。

  確保孵育溫度均勻，避免培養(yǎng)皿堆疊。

  嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，并記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

  3.環(huán)境控制:

  避免陽(yáng)光直射，避免溫度和濕度劇烈變化。

  保持工作區(qū)域清潔，防止污染。

  4.試劑盒質(zhì)量檢測(cè):

  空白對(duì)照(B)和零濃度對(duì)照(ZC):評(píng)估試劑盒的背景信號(hào)和檢測(cè)限。

  最大結(jié)合對(duì)照(MaxBinding):評(píng)估試劑盒的靈敏度和飽和度。

  標(biāo)準(zhǔn)品:使用標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證試劑盒的準(zhǔn)確性和精密度。

  重復(fù)性:進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證試劑盒的結(jié)果重復(fù)性。

  最后，ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范，注意細(xì)節(jié)，并使用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚砗蛢?chǔ)存，有助于在ELISA實(shí)驗(yàn)中獲得準(zhǔn)確和一致的結(jié)果。