了解His標(biāo)簽：實(shí)驗(yàn)室中的重要工具

  在實(shí)驗(yàn)室里或許你或多或少接觸過His檢測，His也叫“組氨酸標(biāo)簽（Histidinetag）”，它具有蛋白質(zhì)純化和檢測作用。通過使用His標(biāo)簽，科研人員能夠快速、有效地獲得高純度的目標(biāo)蛋白質(zhì)，并在各種實(shí)驗(yàn)中對其進(jìn)行詳細(xì)分析。廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、功能研究以及生物技術(shù)和醫(yī)藥開發(fā)等領(lǐng)域。接下來，上海通蔚詳細(xì)給大家介紹一下His標(biāo)簽。相關(guān)閱讀：什么是HIS試劑盒？一文了解其用途研究

  His標(biāo)簽的基本原理和功能

  His標(biāo)簽的組成

  His標(biāo)簽是由6個(gè)組氨酸殘基首尾相連組成的短肽序列，通常連接在蛋白質(zhì)的N端或C端，用于重組蛋白的分離和純化。由于His標(biāo)簽分子量小，它對重組蛋白的結(jié)構(gòu)及生物活性通常沒有顯著影響。His標(biāo)簽?zāi)軌蚺c鎳離子（Ni2?）或鈷離子（Co2?）結(jié)合，通過金屬親和層析進(jìn)行純化。His標(biāo)簽的存在也允許通過抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行特異性識(shí)別，從而用于定性和定量檢測His融合蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位等。

  His標(biāo)簽的基本原理

  His標(biāo)簽蛋白純化通常采用固定化金屬離子親和層析（IMAC）純化的方法。這種方法利用了His標(biāo)簽與金屬離子的特殊相互作用，實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)蛋白的分離和純化。

  原理概述：His標(biāo)簽是由多個(gè)組氨酸殘基組成的短肽，具有與鎳（Ni2?）、鈷（Co2?）等金屬離子結(jié)合的能力。在IMAC層析柱中，這些金屬離子通過螯合配體固定在介質(zhì)上，形成了親和層析填料。

  吸附和洗脫：帶有His標(biāo)簽的蛋白在經(jīng)過裝配了金屬離子的層析介質(zhì)時(shí)能夠選擇性結(jié)合在介質(zhì)上，而其他雜質(zhì)蛋白則不能或僅能微弱結(jié)合。通過調(diào)節(jié)洗脫緩沖液中的咪唑濃度，可以競爭性地洗脫目標(biāo)蛋白，從而實(shí)現(xiàn)分離和純化。

  選擇的金屬離子：在His標(biāo)簽蛋白純化中，常用的金屬離子包括Ni2?、Co2?和Cu2?。其中，Ni2?是最常用的金屬離子，通常選擇Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化。

  His標(biāo)簽的主要功能

  蛋白質(zhì)的親和純化

  在大腸桿菌等原核系統(tǒng)中表達(dá)的多組氨酸標(biāo)簽（His標(biāo)簽）重組蛋白通常通過固定化金屬離子親和層析（IMAC）進(jìn)行純化。在此過程中，載體材料（通常是珠狀瓊脂糖或磁性顆粒）衍生化為具有適當(dāng)配體（如腈三乙酸（NTA）或亞氨基二乙酸（IDA））的形式。

  這些配體將固定所需的二價(jià)金屬離子（如鎳、銅、鈷和/或鋅），而這些金屬離子又負(fù)責(zé)與目標(biāo)生物分子和蛋白質(zhì)混合物結(jié)合和分離。在選擇配體時(shí)，需要考慮要純化的蛋白質(zhì)性質(zhì)以及使用的金屬離子。以下是對金屬離子的選擇的更詳細(xì)描述：

  鎳（Ni2?）：是最常用的金屬離子之一，對His標(biāo)記蛋白具有較高的親和力和選擇性。然而，它可能會(huì)與含有組氨酸簇的內(nèi)源性蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合。

  鈷（Co2?）：與組氨酸標(biāo)簽具有更特異的結(jié)合，因此在追求純度的情況下是首選的二價(jià)陽離子。

  銅（Cu2?）：與His標(biāo)簽的結(jié)合力更強(qiáng)，但其特異性較低。因此，在不要求高純度的情況下才使用銅IMAC。

  對于每種金屬離子，都需要權(quán)衡其親和性和特異性，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)的特定需求做出選擇。這樣的純化方法在生物制藥和生物化學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用，以提取具有特定標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，并保持其活性和結(jié)構(gòu)完整性。

  蛋白質(zhì)檢測

  除了純化多組氨酸標(biāo)記的重組蛋白外，His標(biāo)簽還具有多種其他應(yīng)用：

  ELISA或WesternBlot檢測：

  您可以利用鎳螯合辣根過氧化物酶來促進(jìn)基于HRP的His標(biāo)記蛋白檢測，而無需使用抗體。或者，您也可以使用對帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)具有高靈敏度和特異性的抗6xHis抗體。

  蛋白質(zhì)相互作用分析：

  鎳瓊脂糖樹脂可用于純化、鑒定和測量His標(biāo)記蛋白的相互作用物，從而幫助研究蛋白質(zhì)間的相互作用。

  微孔板涂層：

  鎳或銅涂層微孔板可將粗或半純化樣品中的融合蛋白包被于各種板和報(bào)告基因檢測中，用于高通量的蛋白質(zhì)檢測和篩選。

  凝膠染色：

  有幾種免疫分析方法利用多組氨酸標(biāo)簽，通過抗多組氨酸標(biāo)簽抗體或SDS-PAGE檢測目標(biāo)蛋白，用于蛋白質(zhì)的定性和定量分析。

  熒光標(biāo)記：

  熒光六組氨酸標(biāo)簽的開發(fā)使研究人員能夠更好地研究蛋白質(zhì)的遷移和運(yùn)輸，提供了一種可視化的方式來追蹤蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)過程。

  HIS標(biāo)簽優(yōu)勢

  His標(biāo)簽正逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)及其他生物工程產(chǎn)物最有效的技術(shù)之一，His標(biāo)簽單克隆抗體可用于鑒定His標(biāo)簽蛋白的表達(dá)情況（如目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量、分子量）、在細(xì)胞內(nèi)的位置等特性。

  His標(biāo)簽是蛋白純化的首選，其優(yōu)點(diǎn)有：

  （1）N端His標(biāo)簽與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制相兼容，有利于蛋白的表達(dá)；

  （2）采用IMAC（固定化金屬離子親和層析技術(shù)）純化His標(biāo)簽融合蛋白更為方便；

  （3）His標(biāo)簽對目的蛋白本身的特性幾乎不影響，不會(huì)改變目的蛋白本身的溶解性和生物學(xué)功能；

  （4）His標(biāo)簽很小，一般不影響蛋白的功能，且融合蛋白結(jié)晶后對蛋白的結(jié)構(gòu)沒有影響；

  （5）His標(biāo)簽的免疫原性較低，純化的蛋白可直接注射入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫和抗體制備；

  （6）與其他親和標(biāo)簽構(gòu)建成雙親和標(biāo)簽，可適用于多種表達(dá)體系，純化條件溫和；His標(biāo)簽融合蛋白應(yīng)用范圍廣泛，可在非離子表面活性劑中純化，也可在變性條件下純化，前者通常用于純化疏水性較強(qiáng)的目的蛋白，而后者通常用于純化包涵體蛋白。

  His標(biāo)簽通常存在以下問題：

  (1)由于宿主蛋白的非特異性結(jié)合導(dǎo)致靶標(biāo)純度低

  （2）樣品或緩沖液成分干擾蛋白質(zhì)結(jié)合

  （3）由于緩沖液成分不兼容，純化后蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀

  （4）哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基干擾蛋白質(zhì)結(jié)合或?qū)е?/span>Ni2+泄漏

  （5）目標(biāo)蛋白所需的pH值導(dǎo)致其從Ni-NTA瓊脂糖中洗脫

  （6）由于標(biāo)簽-配體親和力和特異性較低，在蛋白質(zhì)分析中的適用性有限

  為了避免或解決這些問題，需要仔細(xì)規(guī)劃流程并優(yōu)化His標(biāo)簽純化方案。最終，His標(biāo)簽可能仍無法達(dá)到令人滿意的結(jié)果，或者可能根本不適合某種類型的蛋白質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)考慮使用不同的親和標(biāo)簽。

  通過上文介紹，相信你對His標(biāo)簽更了解，詳情的了解His標(biāo)簽有助于后續(xù)實(shí)驗(yàn)純化蛋白和檢測蛋白。純化蛋白和檢測蛋白在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中都具有重要的作用，它們?yōu)槲覀兩钊肓私馍飳W(xué)過程、疾病發(fā)生機(jī)制以及藥物研發(fā)提供了重要的實(shí)驗(yàn)手段和技術(shù)支持。