優(yōu)化ELISA試劑盒：提高靈敏度的關(guān)鍵要素

  內(nèi)容列表：

  ELISA 簡(jiǎn)介

  ELISA試劑盒中匹配的抗體對(duì)

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定樣品

  ELISA 封閉和洗滌步驟

  如何提高ELISA靈敏度

  ELISA 簡(jiǎn)介

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 ( ELISA ) 是現(xiàn)有的最靈敏和可重復(fù)性最高的技術(shù)之一。這些測(cè)定快速、易于執(zhí)行且易于自動(dòng)化。與任何檢測(cè)一樣，ELISA 的重現(xiàn)性和可靠性取決于正確的技術(shù)和對(duì)細(xì)節(jié)的關(guān)注。

  ELISA技術(shù)分為：

  直接 ELISA，其中抗原固定在 ELISA 板上，一抗帶有標(biāo)記（圖 1 A）

  間接 ELISA，其中抗原固定在 ELISA 板上，二抗帶有標(biāo)記（圖 1 B）

  三明治 ELISA，其中兩個(gè)一抗（用于捕獲和檢測(cè)）嵌入抗原，形成“三明治”，然后復(fù)合物被二抗標(biāo)記抗體識(shí)別（圖 1 C）。

  圖 1. ELISA 格式的類(lèi)型：A) 直接、B) 間接和 C) 夾心 ELISA。

  ELISA 試劑盒中匹配的抗體對(duì)

  匹配對(duì)是指已知可識(shí)別同一蛋白質(zhì)抗原上不同表位的抗體組，因此它們可以一起用于夾心 ELISA 中捕獲和檢測(cè)單個(gè)抗原。ELISA 測(cè)定中使用的抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體或兩者的組合。

  單克隆抗體可用于所有類(lèi)型 ELISA 中所有含抗體的步驟。它們通常在夾心 ELISA 中成組使用，但也可與多克隆抗體結(jié)合用于捕獲或檢測(cè)，以增強(qiáng)信號(hào)或提供更大的從復(fù)雜溶液中捕獲抗原的機(jī)會(huì)。

  由于多克隆抗體溶液中抗體的異質(zhì)性和表位的廣泛代表性，多克隆抗體可以成為檢測(cè)抗原的強(qiáng)大工具，通常比單克隆抗體產(chǎn)生更高的信號(hào)水平。然而，多克隆抗體更有可能與密切相關(guān)的蛋白質(zhì)共享一個(gè)或多個(gè)表位，從而導(dǎo)致更高的非特異性信號(hào)。減少該問(wèn)題的一種方法是使用親和純化或交叉吸收的多克隆抗體。為了提高測(cè)定靈敏度，可以將 ELISA 的檢測(cè)方法從直接檢測(cè)轉(zhuǎn)換為使用多克隆抗體的間接檢測(cè)。

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定樣品

  ELISA 可以測(cè)試多種樣品，測(cè)定條件的選擇將取決于樣品的復(fù)雜性和預(yù)期存在的抗原量。

  重要的是要結(jié)合已知標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有樣品進(jìn)行一式兩份或三次測(cè)試，以確保結(jié)果和定量的準(zhǔn)確性。

  最好測(cè)試樣品的幾種稀釋度，以確保最終結(jié)果落在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性部分內(nèi)。高度濃縮的樣品可能會(huì)低估濃度，而高度稀釋的樣品可能會(huì)高估濃度。

  ELISA 封閉和洗滌步驟

  通常需要進(jìn)行封閉，以防止檢測(cè)抗體與多孔板表面本身的非特異性結(jié)合。當(dāng)板完全封閉時(shí)，由于非特異性信號(hào)將減少，因此測(cè)定靈敏度將增強(qiáng)。

  徹底的清洗程序?qū)τ讷@得可靠的 ELISA 結(jié)果至關(guān)重要。重要的是通過(guò)輕輕地將吸液頭放入底部來(lái)完全吸出所有孔中的液體。避免劃傷孔的內(nèi)部。清洗完成后，建議將板倒置并在吸水紙上擦干。

  如何提搞elisa試劑盒靈敏度

  捕獲抗體濃度

  在包被緩沖液中制備不同濃度的捕獲抗體。

  阻塞緩沖區(qū)

  準(zhǔn)備不同的封閉液。如果封閉液未預(yù)先配制（即，它是單一蛋白質(zhì)，例如 BSA），請(qǐng)嘗試不同濃度的蛋白質(zhì)。

  標(biāo)準(zhǔn)稀釋液

  盡量使標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑與樣品基質(zhì)盡可能匹配。

  如果基質(zhì)本身不能精確復(fù)制，則測(cè)試不同的標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液并檢查樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和稀釋線(xiàn)性?？赡苄枰x擇不同的稀釋劑。

  如果樣品的線(xiàn)性度較差，則樣品基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑之間可能存在不平衡。在這種情況下，應(yīng)進(jìn)行加標(biāo)回收或稀釋線(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。

  樣品濃度

  準(zhǔn)備不同濃度的樣品，同時(shí)牢記底物的檢測(cè)限。為了確認(rèn)生物樣品基質(zhì)不會(huì)掩蓋或增強(qiáng)信號(hào)，應(yīng)進(jìn)行加標(biāo)和回收以及稀釋線(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。

  檢測(cè)抗體濃度

  制備不同濃度的檢測(cè)抗體。

  酶結(jié)合物濃度

  根據(jù)底物描述的 ELISA 試劑盒范圍制備不同濃度的酶綴合物。

  信號(hào)檢測(cè)

1.   根據(jù)樣品中抗原的量以及用讀板器檢測(cè)抗原的能力來(lái)選擇底物。
2.   如果可以清楚地檢測(cè)到抗原，則底物是合適的。
3.   如果抗原低于檢測(cè)閾值，則選擇更靈敏的底物。