哪種 ELISA 技術(shù)適合您科研？一文為您解析

  酶聯(lián)免疫吸附測定 ( ELISA ) 由 Engvall 和 Perlmann (1971)首次提出，最初用于檢測免疫球蛋白 G。這種免疫測定是對當時常見的放射免疫測定的一個可喜的變化，后者利用放射性標記的抗體和抗原。ELISA 的發(fā)展基于 20 世紀 60 年代的觀察，即抗體或抗原可以吸附到固體表面并仍然參與高親和力結(jié)合。術(shù)語 ELISA 現(xiàn)在指的是多種免疫測定法，其中一些不涉及酶促反應(yīng)。然而，所有 ELISA 的共同點是使用抗體，抗體在確定測定的靈敏度和特異性方面發(fā)揮著重要作用。

  ELISA 用于生物醫(yī)學研究和發(fā)現(xiàn)的多個領(lǐng)域以及診斷目的。進行 ELISA 的方法有很多種，確定哪一種方法最適合解決您的特定研究問題取決于多種因素，包括所需的靈敏度或檢測的具體內(nèi)容。在這里，上海通蔚生物描述了不同類型的 ELISA，重點介紹每種類型的優(yōu)點和缺點，以及選擇 ELISA 技術(shù)之前應(yīng)考慮的事項。

  有哪些類型的 ELISA？

  有四種 ELISA 技術(shù)可應(yīng)用于您的研究。選擇合適的抗體取決于可用的抗體、所需的結(jié)果以及樣品的復(fù)雜性。ELISA 技術(shù)包括：直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA 和競爭或抑制 ELISA。

  直接ELISA

圖 1 展示了直接 ELISA 的典型設(shè)置。通常，抗原被固定至多孔板。然后通過直接與辣根過氧化物酶 (HRP) 等酶綴合的抗體檢測抗原。

圖1 直接elisa

  優(yōu)點：

  1. 由于所需步驟較少，因此比其他 ELISA 技術(shù)快得多。

  2. 由于所需試劑和步驟較少，因此測定不易出錯。

  缺點：

  1. 由于固定抗原的方法不具有特異性，這可能會導(dǎo)致比間接 ELISA 更高的背景噪音（如下所述）。這主要是因為樣品中的所有蛋白質(zhì)（包括目標蛋白質(zhì)）都會與板結(jié)合。

  2. 靈活性較差，因為每種靶蛋白都需要特定的綴合一抗。

  3. 無信號放大，降低了測定靈敏度。

  直接ELISA應(yīng)用范圍：

  當需要分析針對抗原的免疫反應(yīng)時，通常使用直接 ELISA 技術(shù)。

  間接ELISA

在該 ELISA 技術(shù)中，分兩步檢測固定在多孔板上的抗原。首先，未標記的一抗（通常是單克?。┙Y(jié)合特定抗原。其次，應(yīng)用針對一抗宿主物種的酶聯(lián)二抗（通常是多克?。?。

圖2 間接elisa

  優(yōu)點：

  1. 靈敏度高，因為多個標記的二抗可以結(jié)合一抗。

  2.經(jīng)濟，因為需要更少的標記抗體。

  3. 具有靈活性，因為不同的一抗可以與單一標記的二抗一起使用。

  缺點：

  1. 由于使用二抗而可能發(fā)生交叉反應(yīng)，這可能會增加背景噪音。

  2. 由于需要與二抗孵育步驟，因此比直接 ELISA 技術(shù)的程序更長。

  間接ELISA應(yīng)用范圍:

  間接 ELISA 技術(shù)適用于測定樣品中的總抗體濃度。

  夾心ELISA

  夾心 ELISA 需要使用匹配的抗體對（捕獲抗體和檢測抗體）。因此，每種抗體對抗原的不同且不重疊的區(qū)域或表位具有特異性。重要的是，在 ELISA 中專門測試匹配的抗體對，以確保它們檢測到不同的表位，從而獲得準確的結(jié)果。夾心 ELISA 的程序包括用捕獲抗體涂覆聚苯乙烯板。然后添加分析物或樣品，然后添加檢測抗體。檢測抗體可以是酶聯(lián)的，在這種情況下，這被稱為直接夾心 ELISA。如果使用的檢測抗體未標記，則需要酶聯(lián)檢測二抗。這稱為間接夾心 ELISA。

單克隆和多克隆抗體均可用于夾心 ELISA。然而，多克隆抗體通常用作捕獲抗體，以盡可能捕獲最大量的抗原。

圖3 夾心elisa

  優(yōu)點：

  1、靈敏度高；其靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍。

  2.使用兩種抗體，特異性高。

  3. 提供靈活性，因為可以使用直接和間接方法。

  缺點：

  如果不使用標準化 ELISA 試劑盒或經(jīng)過測試的抗體對，抗體優(yōu)化可能會很困難，因為減少捕獲抗體和檢測抗體之間的交叉反應(yīng)非常重要。

  夾心ELISA應(yīng)用范圍：

  夾心 ELISA特別適合分析復(fù)雜樣品，因為在使用這種方法進行測量之前不需要純化抗原。

  競爭/抑制 ELISA

競爭/抑制 ELISA，也稱為封閉 ELISA，可能是所有 ELISA 技術(shù)中最復(fù)雜的。然而，上述每種測定類型都可以適應(yīng)競爭形式。競爭/抑制 ELISA 主要用于通過檢測預(yù)期信號輸出中的干擾來測量樣品中抗原或抗體的濃度。本質(zhì)上，樣品抗原或抗體與參考分別競爭結(jié)合有限量的標記抗體或抗原。樣品抗原濃度越高，輸出信號越弱，表明信號輸出與樣品中抗原的量成反比。

圖4 競爭ELISA

  圖 4 顯示了基于直接檢測方法的競爭 ELISA 測試抗原的示例。在此示例中，使用已知抗原包被多孔板。按照標準封閉和洗滌步驟，添加含有未知抗原的樣品。然后使用標記的檢測抗體使用相關(guān)底物（例如3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺或TMB）進行檢測。如果樣品中抗原濃度高，則會觀察到信號輸出顯著減少。相反，如果樣品中的抗原非常少，則預(yù)期信號輸出將幾乎沒有減少。在圖 4 所示的示例中，信號輸出將會減少。

  優(yōu)點：

  1. 競爭性ELISA的主要優(yōu)點是無需樣品處理，可以使用粗制或不純的樣品。

  2. 與夾心 ELISA 相比，對樣品稀釋和樣品基質(zhì)效應(yīng)的敏感性較低。

  3. 重復(fù)樣品之間和測定之間的變異性較小。

  4. 實驗設(shè)置具有最大的靈活性，因為它可以基于直接、間接或夾心 ELISA。

  缺點：

  由于每種 ELISA 技術(shù)都可以適應(yīng)競爭性形式，因此上述每種 ELISA 技術(shù)所描述的相同限制將適用于相應(yīng)的競爭性/抑制 ELISA 技術(shù)。

  當只有一種抗體可用于感興趣的抗原時，通常使用競爭/抑制 ELISA 技術(shù)。它還適用于檢測不能被兩種不同抗體結(jié)合的小抗原，例如夾心 ELISA 技術(shù)。

  選擇合適的 ELISA 技術(shù)時要考慮的事項

  如上所述，有許多因素決定哪種 ELISA 技術(shù)適合解決您的研究問題。在決定哪一個適合您之前需要考慮以下幾個問題:

  您需要檢測什么？

  例如，如果檢測具有多個表位的大蛋白（例如細胞因子），則夾心 ELISA 將是最合適的。然而，如果檢測到半抗原等小分子，那么在這種情況下競爭性 ELISA 會更合適。

  有哪些試劑可用于您感興趣的抗原或抗體

  如果只有一種抗體可用于感興趣的抗原，則可以應(yīng)用直接或競爭性 ELISA。

  您想測量免疫反應(yīng)或分析物嗎？

  如果您需要檢測或定量分析物，則可以使用夾心法或競爭性 ELISA。然而，如果您需要測量免疫反應(yīng)，那么直接或間接 ELISA 最適合您的需求。