ELISA結果 - 定量、定性和靈敏度

在ELISA試劑盒測定產(chǎn)生三種不同類型的數(shù)據(jù)輸出：

定量

可以通過與標準曲線（已知純化抗原的連續(xù)稀釋）進行比較來解釋 ELISA 數(shù)據(jù)，以便精確計算各種樣品中抗原的濃度（圖 1）。

定性

ELISA 還可用于獲得“是”或“否”的答案，表明與不含抗原或不相關對照抗原的空白孔相比，樣品中是否存在特定抗原。

半定量

ELISA 可用于比較測定樣品中抗原的相對水平，因為信號強度將直接隨抗原濃度變化。

標準曲線

ELISA 數(shù)據(jù)通常用光密度與對數(shù)濃度作圖，以生成 S 形曲線，如圖 1 所示。已知濃度的抗原用于生成標準曲線，然后通過與已知濃度的抗原進行比較，使用該數(shù)據(jù)來測量未知樣品的濃度。標準曲線的線性部分。這可以直接在圖表上完成，也可以使用 ELISA 讀板機上常見的曲線擬合軟件來完成。

圖 1. 典型的 ELISA 標準曲線。

校準曲線模型

如果需要定量結果，最簡單的方法是對三份標準讀數(shù)進行平均，并扣除空白對照樣品的讀數(shù)。接下來，繪制標準曲線，找到最佳擬合線或至少繪制一條點對點曲線，以便可以確定樣品的濃度。在此階段需要調(diào)整任何稀釋度。這通常是可以進行手動計算的實際程度。

一種變體是使用半對數(shù)、對數(shù)/對數(shù)、對數(shù)/對數(shù)及其導數(shù)（4 或 5 參數(shù)邏輯模型）繪制數(shù)據(jù)。使用基于軟件/自動化的解決方案可以考慮更復雜的繪圖方法。在軟件包中使用線性回歸增加了更多檢查的可能性；可以檢查 R2 值以確定總體擬合優(yōu)度。對于濃度與讀數(shù)之間呈線性關系的曲線部分，R2 值 >0.99 表示非常適合。然后可以通過使用該范圍內(nèi)的更多標準濃度來進一步提高準確性。

線性圖的一方面是它壓縮了標準曲線較低濃度上的數(shù)據(jù)點，從而使其成為最準確的范圍（最有可能達到所需 R2 值的區(qū)域）。為了抵消這種壓縮，可以使用半對數(shù)圖表；這里，濃度值的對數(shù)（x 軸）相對于讀數(shù)（y 軸）繪制。該方法給出了 S 形數(shù)據(jù)曲線，將更多的數(shù)據(jù)點分布到更用戶友好的 S 形模式中。

對數(shù)/對數(shù)（濃度對數(shù)與讀數(shù)對數(shù)）繪圖類型設法使更多數(shù)據(jù)曲線線性化。在此模型中，低到中標準濃度范圍通常是線性的，只有范圍的高端傾向于傾斜。 log/logit 及其導數(shù)（4 或 5 參數(shù)邏輯模型）更加復雜，需要更復雜的計算和最大值、最小值、EC50 和斜率值的估計。 5 參數(shù)模型還需要不對稱值。

雖然這些校準曲線模型可以提供改進的性能，但一個好的起點是使用雙對數(shù)圖并檢查回收率（加標樣品中的分析物回收率）?；蛘?，至少“反向擬合”標準曲線讀數(shù)值通常是“足夠好的”方法。最簡單的檢查方法是反算校準標準并檢查它們是否在標稱讀數(shù)值的 20% 范圍內(nèi)。需要注意的是，不要依賴“良好”的 R2 值并找到可為標準品提供最佳回收率值的校準曲線模型。

ELISA 靈敏度

ELISA 是可用的最靈敏的免疫測定之一。 ELISA 的典型檢測范圍為 0.1 至 1 fmole 或 0.01 ng 至 0.1 ng，靈敏度取決于抗體-抗原相互作用的特定特征。此外，一些底物（例如產(chǎn)生增強化學發(fā)光或熒光信號的底物）可用于改善結果。

如前所述，間接檢測會產(chǎn)生更高水平的信號，因此應該更靈敏。然而，它也可能導致較高的背景信號，從而降低凈特定信號水平。

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