elisa實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：如何準(zhǔn)備 ELISA 樣品

  ELISA是一種對(duì)于幫助定量給定樣品中存在的靶標(biāo)數(shù)量非常重要的程序。正確準(zhǔn)備樣品至關(guān)重要，這對(duì)于確定ELISA 實(shí)驗(yàn)是否成功至關(guān)重要。

 

  樣品準(zhǔn)備好后，可以將其等分并冷凍以進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。建議儲(chǔ)存條件如下：2-8°C 5 天，-20°C 6 個(gè)月，-80°C 2 年。還建議從存儲(chǔ)中取出樣品時(shí)避免重復(fù)凍融循環(huán)，這就是為什么最好以較小的等分試樣存儲(chǔ)樣品。

 

  有許多不同的樣品可用于ELISA 方法。下面將討論一些最常見(jiàn)的樣品，并將提供有關(guān)如何最好地準(zhǔn)備每個(gè)樣品的一般說(shuō)明。但是，我們建議遵循每個(gè)試劑盒提供的具體說(shuō)明，因?yàn)橐粋€(gè)試劑盒與另一個(gè)試劑盒的方案可能略有不同。

 

  不同的樣品類(lèi)型

 

  一、血液樣本

 

  血清：不含任何血細(xì)胞或凝血因子；它就像沒(méi)有纖維蛋白原的血漿。

 

  （a）使用血清分離管收集全血樣本，方法是將其在室溫下靜置 2 小時(shí)或在 2-8°C 之間過(guò)夜。需要注意的是，這是一種自然的血液凝固方法。此外，如果溫度降低，凝血過(guò)程也會(huì)減慢。

 

  （b）、然后將樣品以 1000 x g 離心 20 分鐘。

 

  （c）、將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （d）、可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。

 

  血漿（EDTA、檸檬酸、肝素）：這些樣品需要抗凝，這取決于所使用的目標(biāo)分析物。

 

  （a）、將血漿收集到含有所需抗凝劑的試管中并輕輕混合。

 

  （b）、收集樣品后 30 分鐘內(nèi)將樣品在 2-8°C 下以 1000 xg 離心 15 分鐘。

 

  （c）、將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （d）、可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。

 

  組織樣本

 

  幾乎所有的組織樣本都被加工成組織勻漿。所使用的方案很大程度上取決于將用作樣本的提取組織?？赡苄枰~外的蛋白質(zhì)抑制劑以最小化或防止分析物的任何進(jìn)一步降解。

 

  （a）、必須使用干凈的工具解剖組織，然后必須將其快速放置在冰上以防止蛋白酶發(fā)生任何潛在的降解。

 

  （b）、使用預(yù)冷卻的 0.01M PBS 緩沖液（pH 7.4）清洗組織，這應(yīng)該去除可能存在的任何殘留血液。

 

  （C）、然后在均質(zhì)化之前稱(chēng)量組織。

 

  （d）、將處理后的勻漿以 5000 xg 離心 5 分鐘。

 

  （e）、將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （F）可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。

 

  已發(fā)現(xiàn)一些組織樣本顯示假陽(yáng)性結(jié)果，這是由于內(nèi)源生物素與親和素和鏈霉親和素相互作用。這些組織的包括腎、肝、胰腺和腦組織。

 

  細(xì)胞樣本

 

  細(xì)胞裂解物：首先需要裂解細(xì)胞，以便將其用于ELISA 分析。裂解步驟可以是使用 Triton X-100、脫氧膽酸鈉、RIPA、SDS、DTT 和尿素等試劑的化學(xué)過(guò)程，也可以是物理過(guò)程，例如使用重復(fù)凍融循環(huán)或超聲處理。一般來(lái)說(shuō)，物理程序是更好的選擇，因?yàn)槭褂没瘜W(xué)品可能會(huì)對(duì)ELISA 結(jié)果產(chǎn)生下游影響。

 

  （a）、使用胰蛋白酶溶液將貼壁細(xì)胞分離成懸浮液，然后將其離心，并將上清液收集到干凈的管中?？梢詫⒁呀?jīng)懸浮的細(xì)胞離心并收集上清液。

 

  （b）、將細(xì)胞加入預(yù)冷的 PBS 中并洗滌 3 次。

 

  （c）、然后使用化學(xué)或物理方法裂解細(xì)胞。例如：可添加0.5ml RIPA裂解緩沖液，超聲四次或凍融樣品四次。

 

  （d）、以 1500 xg 離心 10 分鐘，以去除可能存在的細(xì)胞碎片。

 

  （e）、將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （f）、可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。

 

  （g）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液：當(dāng)研究分泌蛋白作為目標(biāo)分析物時(shí)，強(qiáng)烈推薦這種樣品類(lèi)型。

 

  （h）、1000 xg 離心 20 分鐘，這將去除可能存在的任何沉淀物。

 

  （l）、將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （j）可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。

 

   唾液、牛奶和尿液樣本

 

  這些樣本變得越來(lái)越受歡迎，因?yàn)榕c血液樣本相比，它們的侵入采集程序要少得多。它們經(jīng)常用于檢測(cè)大量抗微生物劑、分泌的分析物和許多其他生物酶。

 

  （a）、樣品收集在無(wú)菌離心管中。

 

  （b）、然后在 2-8°C 下以 10,000 xg 離心 2 分鐘或以 2000-3000 rpm 離心 20 分鐘。

 

  （c）、’將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （d）、可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。

 

  痰標(biāo)本

 

  痰可以被描述為主要存在于呼吸道中的粘液和唾液的混合物。通常通過(guò)咳嗽從肺部排出。痰中可能存在許多令人特別感興趣的病原菌。

 

  （a）、對(duì)痰的粘稠部分進(jìn)行稱(chēng)重。

 

  （b）、稱(chēng)取的痰液中加入等量的0.1% DTT（具有溶解痰液的作用），并在35℃下混合5分鐘。

 

  （c）、將等量的 PBS 添加到混合物中（1/2 稀釋?zhuān)?，繼續(xù)混合 15-20 分鐘。

 

  （d）、使用金屬絲網(wǎng)過(guò)濾混合物。

 

  （e）、1500 rpm 離心 10 分鐘。

 

  （f）、’將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （g）、可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。

 

  腦脊液、腹水和支氣管肺泡灌洗液 (BALF) 樣本

 

  （a）、收集樣品后，以 1,2000 rpm 離心 20 分鐘。

 

  （b）、檢查確保沒(méi)有沉淀，如果有沉淀需要重新離心。

 

  （c）、將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （d）、’可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。

 

  精液樣本

 

  （a）、精液樣本應(yīng)收集在無(wú)菌容器中。

 

  （b）、將容器放入室溫或 37°C 的水浴中。這將使纖溶酶使精液變稀并液化。

 

  （c）、將液化精液以4000rpm離心10分鐘，以分離精漿。

 

  （d）、將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （e）、可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。

 

  糞便樣本

 

  （a）、收集超過(guò) 50 毫克的干糞便樣本。值得注意的是，稀釋的糞便樣本更難處理，并且更難以檢測(cè)，因?yàn)闇?zhǔn)確性降低。

 

  （b）、使用 PBS 將糞便樣本清洗 3 次。

 

  （c）、離心步驟后，用 PBS 重懸（1g 糞便與 9ml PBS 的比例）?？梢允褂贸暡ǚ鬯槿芤骸?/span>

 

  （d）、5000 xg 離心 10 分鐘。

 

  （f）、將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的管中。

 

  （g）、可以立即分析，也可以冷凍（-20°C 或-80°C）以供以后使用。