PCR 技術(shù)新篇章：染料法 PCR 詳解

  上篇文章介紹了探針?lè)?/span>PCR及它的工作原理，這篇文章，我們來(lái)認(rèn)識(shí)下PCR技術(shù)—染料法PCR。這聽(tīng)起來(lái)有點(diǎn)像探針?lè)?/span>PCR兄弟，它們都屬于qPCR?，F(xiàn)在，我們一起來(lái)了解下染料法PCR。探針?lè)?PCR可以參考這篇文章《探針?lè)≒CR工作原理詳解：從熒光到基因定量》

  什么是染料法PCR？

  染料法PCR是一種經(jīng)濟(jì)高效的qPCR，可基于DNA結(jié)合染料的熒光檢測(cè)來(lái)測(cè)量PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）過(guò)程中的雙鏈DNA擴(kuò)增。除了qPCR混合物、無(wú)核酸酶水和DNA之外，它只需要兩個(gè)序列特異性引物，這使其成為觀察大量目標(biāo)時(shí)經(jīng)濟(jì)高效的選擇。

  染料法PCR是如何工作的？

  如前所述，染料法PCR使用DNA結(jié)合熒光染料。在與DNA結(jié)合之前，染料呈現(xiàn)低背景熒光。在擴(kuò)增過(guò)程中，染料會(huì)與樣品中發(fā)現(xiàn)的任何雙鏈DNA產(chǎn)物結(jié)合。這導(dǎo)致熒光的增加與每個(gè)循環(huán)中存在的PCR擴(kuò)增子的增加成正比。

  每個(gè)PCR循環(huán)后測(cè)量熒光。當(dāng)足夠的熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合并具有比背景熒光更高的熒光時(shí)，就達(dá)到閾值循環(huán)(Ct)，也稱(chēng)為定量循環(huán)(Cq)。Ct值用于定量樣品中目標(biāo)DNA的量（Ct水平越低，樣品中目標(biāo)DNA的量越大）。

圖1 熒光染料為 SYBR GreenⅠ染料

  染料法PCR被認(rèn)為具有成本效益，因?yàn)槊總€(gè)目標(biāo)只需要兩個(gè)序列特異性引物，但由于這些引物是確定反應(yīng)特異性的唯一方法，因此它的特異性不如傳統(tǒng)PCR或探針?lè)?/span>PCR。然而，它比購(gòu)買(mǎi)探針?lè)?/span>PCR的引物和探針要便宜得多。

  染料法PCR中引物的主要問(wèn)題是它們往往會(huì)形成引物二聚體或非特異性擴(kuò)增子。遺憾的是，該染料將檢測(cè)并結(jié)合任何雙鏈DNA，其中還包括所有脫靶，即非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。這可能導(dǎo)致目標(biāo)序列的定量不準(zhǔn)確。

  然而，有一種簡(jiǎn)單的方法可以識(shí)別問(wèn)題?？梢允褂萌劢馇€(xiàn)來(lái)比較擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度。這可以驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性并檢查非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。

  熔解曲線(xiàn)分析基于以下事實(shí)：不同的雙鏈DNA鏈根據(jù)各種因素（GC含量、SNP等）在不同溫度下彼此解離。當(dāng)PCR產(chǎn)物被加熱并且雙鏈開(kāi)始解離時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生熔解曲線(xiàn)，在此期間熒光染料也從鏈上解離，因此可以檢測(cè)到熒光下降。

  qPCR機(jī)器完成數(shù)據(jù)收集后，您將獲得擴(kuò)增圖，直觀地顯示qPCR期間DNA的積累情況。這些線(xiàn)條顯示了染料的熒光信號(hào)，該信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化為被動(dòng)參考染料（例如ROX）的信號(hào)減去qPCR機(jī)器生成的基線(xiàn)。它應(yīng)該看起來(lái)像這樣：

圖2 SolisFAST® SolisGreen® qPCR 混合物的擴(kuò)增圖

  染料法PCR的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

  染料法PCR如此受科學(xué)家歡迎的原因有很多。這里是其中的一些：

  1、成本（僅2個(gè)引物）——比探針?lè)?/span>PCR更經(jīng)濟(jì)的選擇。

  2、比探針?lè)?/span>PCR更容易設(shè)計(jì)。同樣，前者只需要2個(gè)引物。后者需要2個(gè)引物和一個(gè)非常特殊放置的探針。

  3、與探針?lè)?/span>PCR不同，除了目標(biāo)的基因之外，還可以檢測(cè)錯(cuò)誤。這樣，下次就可以?xún)?yōu)化實(shí)驗(yàn)并獲得更好的結(jié)果。

  遺憾是，與所有方法一樣，染料法PCR并不適合所有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以下是一些缺點(diǎn)：

  1、不可能進(jìn)行多路復(fù)用。

  2、其特異性較低。

  染料法PCR有哪些染料可供選擇？

  染料法PCR最重要的部分當(dāng)然是染料。一些建議，幫助您為qPCR實(shí)驗(yàn)選擇合適的染料。

  經(jīng)典且可能最常用的染料是SYBR®Green。然而，還有更好的選擇，可能還沒(méi)有那么流行，但值得考慮。其中之一是EvaGreen®，它在光譜上與SYBR®Green相似，因此使用時(shí)無(wú)需更改任何光學(xué)設(shè)置。EvaGreen®在室溫和PCR條件下都非常穩(wěn)定。它對(duì)濃度的抑制較小——可以增加染料的濃度以增加熒光，而不會(huì)擾亂反應(yīng)。這還可以實(shí)現(xiàn)更好的高分辨率熔體分析。此外，由于其新穎的“按需釋放”DNA結(jié)合機(jī)制，EvaGreen®染料的背景比SYBR®GreenI更少。最重要的是，EvaGreen®還被認(rèn)為比SYBR®Green毒性更低、對(duì)環(huán)境更安全。

  另一種選擇是SolisGreen®，它也與其他常用的qPCR染料共享光譜特性?；?/span>SolisGreen®染料的qPCR混合物具有高靈敏度和更高的性能（更亮的熒光），目標(biāo)濃度低，顯示出更高的精度和技術(shù)重復(fù)之間的差異更小。

  當(dāng)然還有多種其他染料可供選擇，但所有SolisBioDyne產(chǎn)品均基于EvaGreen®或SolisGreen®，以確保良好的產(chǎn)品穩(wěn)定性、效率和可持續(xù)性。

  上述是染料法PCR介紹，通過(guò)上文你對(duì)染料法PCR有所了解。染料法PCR和探針?lè)?/span>PCR有所差異，可以對(duì)比實(shí)驗(yàn)來(lái)去了解之間的差異。具體選擇染料法和探針?lè)ㄒY(jié)合當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)。如果您對(duì)染料法還有什么疑問(wèn)，可以咨詢(xún)我們?cè)诰€(xiàn)技術(shù)尋求幫助。如果您想了解染料法試劑盒，歡迎前來(lái)咨詢(xún)。