酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定：生物醫(yī)學(xué)研究中的得力助手

  什么是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定？我們普通口語(yǔ)常說(shuō)的elisa其實(shí)叫“酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定”，ELISA是使用抗體的免疫測(cè)定（免疫測(cè)定）之一。抗體是由于異物抗原進(jìn)入體內(nèi)引起免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?？贵w屬于免疫球蛋白(Ig)蛋白質(zhì)家族。免疫球蛋白(Ig)有以下類(lèi)別：

  G(IgG)、M(IgM)、A(IgA)、D(IgD)和E(IgE)。免疫測(cè)定中使用的抗體主要是IgG。IgG是一種分子量約為146,000的糖蛋白，由兩條H鏈（分子量約為50,000）和兩條L鏈（分子量約為25,000）組成。抗體具有僅與導(dǎo)致其產(chǎn)生的抗原結(jié)合的特性（特異性結(jié)合能力）?？乖且环N物質(zhì)，具有：

  1)產(chǎn)生抗體的特性（免疫原性）和與抗體特異性結(jié)合的特性（特異性結(jié)合）。

  2)與抗體結(jié)合但不具有產(chǎn)生抗體特性的物質(zhì)稱(chēng)為半抗原。一般來(lái)說(shuō)，大分子量的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)，具有充當(dāng)抗原的特性。

  3)分子量小于1000的物質(zhì)，例如類(lèi)固醇激素或寡肽，它們像蛋白質(zhì)一樣由氨基酸連接而成，但氨基酸數(shù)量較少，因此分子量較小，無(wú)法產(chǎn)生抗體，具有半抗原特性。問(wèn)題是，為什么有抗體與半抗原結(jié)合，即使它們不產(chǎn)生抗體。事實(shí)上，當(dāng)半抗原與大蛋白質(zhì)分子（稱(chēng)為載體）結(jié)合并進(jìn)行免疫時(shí)，就可以產(chǎn)生抗體。免疫學(xué)測(cè)定是使用抗體作為結(jié)合試劑的測(cè)定，抗體具有僅與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的優(yōu)異的特異性結(jié)合能力，以及允許它們結(jié)合微量物質(zhì)的強(qiáng)親和力。

  ELISA是一種使用抗體和酶的測(cè)量方法

  ELISA中如何使用抗體？ELISA通常使用96孔的微孔板。首先，抗體被吸附到孔的表面（也稱(chēng)為涂層或固定）。這種抗體稱(chēng)為捕獲抗體，用于捕獲作為待測(cè)物質(zhì)的抗原?？贵w可以被認(rèn)為大致呈Y形。Y尖端有一個(gè)可變區(qū)，可識(shí)別并結(jié)合抗原。抗體吸附在孔底手柄易吸附的部分?？椎牟牧现饕蔷郾揭蚁?，天然很容易吸附蛋白質(zhì)，但考慮到各種結(jié)構(gòu)后，它變成了特別容易吸附蛋白質(zhì)的材料。當(dāng)向其中添加抗體溶液時(shí)，會(huì)自動(dòng)發(fā)生吸附。通過(guò)吸附盡可能多的抗體，甚至可以捕獲極少量的抗原。

  那么，如何使用捕獲抗體呢？我們用示意圖來(lái)解釋一下。為了屏幕方便，這里僅顯示一種抗體。事實(shí)上，許多抗體被吸附。

圖1、elisa試劑盒

  將含有抗原的溶液（標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)本或測(cè)量樣品）加入到孔中固定化抗體中，并放置一段時(shí)間，通常為1至2小時(shí)，直至抗原與抗體結(jié)合?？贵w.馬蘇.結(jié)合完成后，丟棄多余的溶液并清洗孔。這樣，只有與固定化抗體結(jié)合的抗原保留在孔中。

  接下來(lái)，添加一種抗體（稱(chēng)為第二抗體），該抗體可識(shí)別與抗原捕獲抗體所識(shí)別的表位不同的表位。我會(huì)把它留一會(huì)兒。該第二抗體預(yù)先與酶化學(xué)結(jié)合。添加的酶標(biāo)記第二抗體識(shí)別并結(jié)合與捕獲抗體結(jié)合的抗原。然后，洗去多余的酶標(biāo)二抗。接下來(lái)，添加酶的顯色底物溶液以允許酶反應(yīng)發(fā)生。顯色底物通過(guò)酶的作用轉(zhuǎn)化為色素。因此，通過(guò)添加反應(yīng)終止液來(lái)終止酶反應(yīng)后，使用96孔微孔板比色計(jì)測(cè)量染料的顯色。這樣，可以將與捕獲抗體結(jié)合的抗原的量作為染料進(jìn)行測(cè)量。比色測(cè)定的結(jié)果以吸光度表示，因此以標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果為橫軸，以抗原濃度，縱軸為吸光度，繪制校準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中抗原的量由此。圖中所示的ELISA實(shí)現(xiàn)方法是最簡(jiǎn)單的方法。由于酶的分子量相當(dāng)大，使用該方法時(shí)，用酶標(biāo)記抗體可能會(huì)對(duì)抗體的結(jié)合能力造成空間阻礙。

圖2、elisa夾心法

  設(shè)計(jì)了一種通過(guò)將酶與另一種蛋白質(zhì)結(jié)合來(lái)減少抗體的空間位阻的方法。如圖所示，二抗帶有生物素標(biāo)記。生物素是一種分子量非常小的物質(zhì)。生物素是一種原本存在于生物體中的生理活性物質(zhì)，蛋清中含有一種叫做親和素的蛋白質(zhì)，它與生物素的結(jié)合力非常強(qiáng)。通過(guò)將酶與該親和素結(jié)合，并使其與與抗原結(jié)合的生物素標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)，可以克服空間位阻。這種改進(jìn)方法也用于ELISA。ELISA也稱(chēng)為夾心法，因?yàn)樗捎每贵w-抗原-抗體格式。