免疫測(cè)定關(guān)鍵：一抗二抗如何選擇？

  免疫測(cè)定在臨床診斷和生物制藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，可用于分析物的定量、定性和半定量分析。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA) 和蛋白質(zhì)印跡等免疫測(cè)定使用抗體來檢測(cè)分析物，方法是響應(yīng)抗體與其靶抗原的結(jié)合而產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。免疫測(cè)定通常需要兩種類型的抗體：一抗和二抗。一抗特異性結(jié)合抗原，而二抗結(jié)合一抗。在這里，我們將討論一抗和二抗在免疫測(cè)定中的工作原理、它們的生產(chǎn)方法以及如何選擇用于免疫測(cè)定的抗體。關(guān)于什么是一抗二抗可以參考《免疫學(xué)檢測(cè)：一抗和二抗簡(jiǎn)介》

  一抗和二抗如何發(fā)揮作用？

  免疫測(cè)定有 3 個(gè)主要組成部分：
  
  1、目標(biāo)分析物：樣品中檢測(cè)到的抗原。
  
  2、抗體
  
    一抗：與目標(biāo)抗原結(jié)合。
  
    二抗：與一抗結(jié)合。
  
  3、標(biāo)記：與一抗或二抗綴合的標(biāo)記，可產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)

  直接與間接免疫測(cè)定

  免疫測(cè)定有兩種類型：直接免疫測(cè)定和間接免疫測(cè)定（圖 1）。在直接免疫測(cè)定中，標(biāo)記物與一抗結(jié)合，并在抗原結(jié)合時(shí)產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)（圖 1，左）。因此，直接免疫測(cè)定是一種一步檢測(cè)方法，不需要二抗進(jìn)行檢測(cè)。

  圖 1.直接與間接免疫測(cè)定。直接免疫測(cè)定利用與信號(hào)分子綴合的一抗。間接免疫測(cè)定需要一抗來檢測(cè)抗原，以及二抗與一抗結(jié)合并產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)。在此示例中，與二抗綴合的 HRP 酶通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)將 HRP 底物催化成可檢測(cè)的光。

  間接免疫測(cè)定利用一抗和二抗進(jìn)行抗原檢測(cè)（圖 1，右）。一抗與抗原結(jié)合，二抗與一抗結(jié)合并通過綴合標(biāo)記促進(jìn)檢測(cè)。二抗有助于信號(hào)放大，因?yàn)槎鄠€(gè)二抗將與單個(gè)一抗結(jié)合。擴(kuò)增過程可以實(shí)現(xiàn)低豐度抗原的可視化，并提高免疫測(cè)定的靈敏度。直接和間接免疫測(cè)定法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如 表 1 所示。

  免疫測(cè)定中使用的標(biāo)記類型

  與抗體結(jié)合的標(biāo)記會(huì)產(chǎn)生信號(hào)，從而可以定量和檢測(cè)樣品中的抗原。免疫測(cè)定中使用多種類型的標(biāo)記，其選擇取決于所進(jìn)行測(cè)定的具體要求。一些常見的例子包括：

  酶：最常見的抗體標(biāo)記類型。通常摻入的酶是辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）。酶聯(lián)抗體的免疫測(cè)定通過化學(xué)發(fā)光或比色檢測(cè)方法進(jìn)行分析。酶常用于蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué) (IHC) 和 ELISA 等技術(shù)。

  熒光染料：熒光染料，例如：異硫氰酸熒光素 (FITC)、德克薩斯紅和羅丹明。熒光染料在特定波長(zhǎng)下的激發(fā)會(huì)產(chǎn)生不同且更長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)射。熒光染料廣泛用于免疫熒光顯微鏡等技術(shù)。

  放射性同位素：用放射性同位素標(biāo)記的抗體通過結(jié)合的抗體復(fù)合物發(fā)射的放射性進(jìn)行測(cè)量。放射性同位素通常用于放射免疫測(cè)定 (RIA)，但由于非放射性替代品的出現(xiàn)，其使用量有所減少。

  生物素：生物素是一種可以與抗體結(jié)合的小分子。生物素可以用鏈霉親和素綴合物（例如鏈霉親和素-HRP）檢測(cè)。

  一抗和二抗是如何產(chǎn)生的？

  一抗是通過體內(nèi)和體外技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的，例如雜交瘤生成、單 B 細(xì)胞測(cè)序和多克隆抗體測(cè)序。

  二抗是通過使用不同目標(biāo)動(dòng)物物種的抗體對(duì)宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫而產(chǎn)生的（圖 2）。例如，通過將兔抗體注射到山羊體內(nèi)，產(chǎn)生山羊抗兔抗體，從而產(chǎn)生抗兔二抗。二抗生產(chǎn)的常見宿主物種包括山羊、驢和兔子。針對(duì)目標(biāo)物種的混合抗體生成二抗，形成二抗的多克隆混合物，可識(shí)別宿主物種的重鏈 (HC) 或輕鏈 (LC)、Fab 和 Fc 區(qū)上的表位。減少二抗的交叉反應(yīng)性可以通過用特定抗體片段免疫宿主來實(shí)現(xiàn)，從而產(chǎn)生針對(duì)特定區(qū)域的二抗，例如僅HC或LC，或Fab片段。從宿主中純化后，抗體標(biāo)記會(huì)與二抗結(jié)合。

圖2.二抗的由來

  選擇免疫測(cè)定的一抗和二抗

  選擇用于免疫測(cè)定的抗體并非易事。選擇正確的抗體時(shí)需要考慮幾個(gè)因素，包括：

  1、確保一抗的種類與樣品的種類不同，以避免與樣品中的內(nèi)源免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。

  2、確保一抗能夠識(shí)別樣品物種中的目標(biāo)蛋白，物種之間的交叉反應(yīng)性由目標(biāo)表位的序列同源性決定。

  3、確保一抗已被驗(yàn)證可用于所需的應(yīng)用。

  4、選擇針對(duì)一抗宿主物種產(chǎn)生的二抗。

  5、選擇與正確標(biāo)記結(jié)合的二抗。例如，對(duì)于免疫熒光，確保二抗具有所需波長(zhǎng)的綴合熒光染料。

上文為大家介紹了免疫測(cè)定一抗和二抗，希望大家對(duì)抗體有個(gè)充分的認(rèn)識(shí)，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程選擇正確的抗體?？蒲新飞希贵w是您不可或缺的伙伴。 上海通蔚，專注于免疫學(xué)試劑研發(fā)與生產(chǎn)，為您提供高質(zhì)量一抗、二抗，助力您的科研事業(yè)更上一層樓。