【通蔚生物】：ELISA試劑流式細胞術知識分享

在流式細胞術中會使用多種熒光試劑，包括熒光偶聯抗體、DNA結合染料、活性染料、離子指示劑染料和熒光蛋白。在過去的幾年里，由于相關試劑種類和數量的增加，用于流式細胞術實驗的參數數量發(fā)生了爆炸性增長。比如，用于偶聯單克隆抗體的熒光染料，如串聯染料和聚合物染料的數量急劇增加。此外，除了GFP之外，可用于轉染的熒光蛋白也有所增加，如mCherry、mBanana、mOrange、mNeptune等。本文就為大家介紹一下常用的流式熒光試劑。

有機小分子

有機小分子如熒光素(MW=389 D)、Alexa Fluor 488(熒光素類似物)、Texas Red (325 D)、Alexa Fluor 647 (1464 D)、Pacific Blue和Cy5 (762 D)通常用于抗體偶聯。它們具有一致的發(fā)射光譜，但有一個小的Stokes位移(激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的差，約50-100 nm)。有機小分子很穩(wěn)定，且很容易與抗體結合。目前，一些染料（例如Alexa Fluor, Thermo Fisher）經過特殊設計，可減小成像時的光漂白效應，是樣品需要成像分析時更好的試劑選擇。

藻膽蛋白

藻膽蛋白是來源于藍藻、鞭毛藻等藻類的大型蛋白質分子。藻膽蛋白的分子量大（例如藻紅素(PE)的分子量為240kD），非常適合于定量流式細胞術，因為它們在偶聯過程中通常有1:1的蛋白質與熒光色素比例。藻膽蛋白具有較大的Stokes位移(75-200 nm)和穩(wěn)定的發(fā)射光譜。然而，藻膽蛋白易受光漂白效應影響，不建議長時間或反復暴露于激發(fā)光源。常用的藻膽蛋白有藻紅蛋白(PE)，藻藍蛋白(APC)和葉綠素蛋白(PerCP)等。
藻紅素及其輔因子結構示意圖

量子點

量子點 (Qdots) 是半導體納米晶體，具有與納米晶體尺寸相關的緊密熒光發(fā)射光譜。它們最適合用紫外或紫色激光激發(fā)，但也可能被多個激光最低限度地激發(fā)。當 Qdots 用于多參數實驗時，這種最小激發(fā)使熒光補償復雜化。由于補償問題和難以結合抗體，Qdots在多參數染色面板中已在很大程度上被聚合物染料取代。

高分子聚合物染料

聚合物染料由收集光信號的聚合物鏈組成，可以根據聚合物鏈的長度和連接的分子亞基，吸收和發(fā)射特定波長的光。聚合物染料非常穩(wěn)定，具有與藻膽蛋白相似的量子效率，且光穩(wěn)定性大大提高。由于聚合物染料只能吸收特定波長的光，因此避免了量子點試劑在多參數實驗中難以進行多次激光激發(fā)的問題。常見的聚合物染料有亮紫(BV)、亮紫外(BUV)和亮藍(BB)試劑。

串聯染料

串聯染料由藻膽蛋白（PE、APC、PerCP）或聚合物染料（BV421、BUV395）與小的有機熒光染料（Cy3、Cy5、Cy7）化學偶聯而成，可用單個激光源進行激發(fā)，這種染料增加了可由單個激光激發(fā)的熒光染料的種類。例如，Texas Red的最大激發(fā)波長為589 nm，PE的發(fā)射波長為585 nm，因此通過將PE偶聯到Texas Red， PE的發(fā)射光通過熒光能量轉移（FRET）激發(fā)Texas Red，使PE-TxRed串聯染料可以被488 nm或532 nm激光激發(fā)。聚合物鏈抗體使用相同的方法來增加可由單個激光激發(fā)的熒光染料。串聯染料非常明亮，具有較大的Stokes位移值 (150-300 nm)，這在處理低抗原密度樣本時非常有用。然而，串聯染料的穩(wěn)定性不如供體熒光染料，而且它們的能量轉移效率因批次而異，使補償變得復雜。大多數較長的Brilliant聚合物染料也是串聯的，也存在上述問題。