PCR擴(kuò)增技術(shù)入門：檢測(cè)試劑盒PCR擴(kuò)增的原理和步驟

  檢測(cè)試劑盒應(yīng)用領(lǐng)域非常的廣泛，包括醫(yī)學(xué)診斷、生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)和環(huán)境和食品安全檢測(cè)。今天，上海通蔚生物給大家說(shuō)一說(shuō)生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)PCR試劑盒。PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）這項(xiàng)技術(shù)是由美國(guó)生物化學(xué)家卡里·穆利斯 (Kary Mullis) 于 1983 年開(kāi)發(fā)的。
  

  

卡里·穆利斯 (Kary Mullis)

  
  說(shuō)起PCR，除了實(shí)驗(yàn)室人比較熟悉之外，就是近年來(lái)的新冠（Covid-19 ）一部分采樣的PCR技術(shù)，通過(guò)此技術(shù)可以確認(rèn)一個(gè)人是否感染病毒。
  

  檢測(cè)試劑盒PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）

  
  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是一種用于醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究的技術(shù)，可復(fù)制DNA 片段（例如特定基因）的數(shù)千甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)副本。它還可用于檢測(cè)基因是否存在，以幫助識(shí)別感染過(guò)程中的病原體。例如，在Covid-19大流行期間，PCR檢測(cè)被用來(lái)檢測(cè)一個(gè)人的拭子樣本是否含有病毒遺傳物質(zhì)的片段，以提供陽(yáng)性或陰性感染結(jié)果。
  

  檢測(cè)試劑盒PCR工作原理及步驟

  

  PCR工作原理

  

  PCR 使用 DNA 聚合酶指導(dǎo)從單鏈 DNA 模板上的脫氧核苷酸底物合成 DNA。當(dāng)定制寡核苷酸與更長(zhǎng)的模板 DNA 退火時(shí)，DNA 聚合酶將核苷酸添加到定制寡核苷酸的 3` 端。因此，如果合成的寡核苷酸與包含與寡核苷酸互補(bǔ)的區(qū)域的單鏈模板退火，DNA聚合酶可以使用寡核苷酸作為引物并延長(zhǎng)其3'端以產(chǎn)生雙鏈DNA的延伸區(qū)域。

  

  PCR五個(gè)核心“原料”

  
  1、要復(fù)制的 DNA 模板。
  
  2、引物——DNA 或 RNA 的短片段，長(zhǎng)度為 20 到 30 個(gè)堿基，結(jié)合感興趣的 DNA 片段的任一側(cè)并標(biāo)記 PCR 的起始點(diǎn)。
  
  3、DNA 核苷酸堿基（也稱為 dNTP）。DNA 堿基（A、T、C 和 G）是 DNA 的組成部分，是構(gòu)建新 DNA 鏈所必需的。
  
  4、一種稱為 Taq 聚合酶的酶，它將堿基添加到復(fù)制的序列中。
  
  5、緩沖液以確保反應(yīng)有合適的條件。
  

  PCR三個(gè)主要階段步驟

  
  步驟1，變性：將雙鏈模板DNA加熱，使其分離成兩條單鏈。
  
  步驟2，退火：降低溫度，使DNA引物附著到模板DNA上。
  
  步驟3，延伸：再次升高溫度，Taq聚合酶產(chǎn)生新的DNA鏈。
  
  這三個(gè)階段重復(fù) 20-40 次，每次 DNA 拷貝數(shù)加倍。這稱為熱循環(huán)，由機(jī)器執(zhí)行。
  
  它是由一臺(tái)稱為熱循環(huán)儀的機(jī)器執(zhí)行的。根據(jù)機(jī)器的速度，PCR 可以在不到一小時(shí)或長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。
  

  PCR 完成后，可以使用一種稱為電泳的方法來(lái)檢查產(chǎn)生的 DNA 片段的數(shù)量和大小。

  

  PCR每個(gè)階段會(huì)發(fā)生什么？

  

  第一步：變性   

  將反應(yīng)混合物加熱至 94-95°C，持續(xù) 15 至 30 秒。
  
  高溫導(dǎo)致模板 DNA 兩條鏈中堿基之間的氫鍵斷裂，兩條鏈分離。
  
  這會(huì)產(chǎn)生兩條單鏈 DNA，它將作為模板產(chǎn)生每條 DNA 鏈的新副本。
  
  重要的是，在此階段保持溫度足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以確保 DNA 鏈完全分離。
  
  第 2 步：退火
  
  將反應(yīng)冷卻，使引物能夠通過(guò)氫鍵連接到單鏈模板 DNA 上的特定位置。
  
  溫度取決于底漆的特性，但通常在 50 至 65?C 之間。
  
  兩條分離的 DNA 鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，并且以相反的方向延伸（從一端 – 5' 端 – 到另一端 – 3' 端）。因此，有兩種引物——正向引物和反向引物。
  
  此步驟至關(guān)重要，因?yàn)橐锿ㄟ^(guò)提供供聚合酶使用的短雙鏈 DNA 區(qū)域而充當(dāng) DNA 合成的起點(diǎn)。只有引物結(jié)合后，聚合酶才能附著并開(kāi)始在延伸步驟中從松散的 DNA 堿基生成新的互補(bǔ) DNA 鏈。
  
  退火步驟通常需要大約10-30秒。
  
  第三步：擴(kuò)展
  
  熱量升至 72?C，以便通過(guò)添加 DNA 堿基的特殊 Taq DNA 聚合酶生成新 DNA。
  
  Taq DNA 聚合酶是一種取自水生棲熱菌 (“Taq”) 的酶：這種細(xì)菌通常生活在溫泉中，可以耐受80℃以上的溫度，但最適溫度為72℃。
  
  該細(xì)菌的 DNA 聚合酶在高溫下非常穩(wěn)定，這意味著它可以承受在 PCR 變性階段將 DNA 鏈分開(kāi)所需的溫度。
  
  大多數(shù)其他生物體的 DNA 聚合酶無(wú)法承受如此高溫。例如，人類聚合酶在 37°C（體溫）下工作效果最佳。
  
  在 72?C 時(shí)，Taq 聚合酶開(kāi)始構(gòu)建互補(bǔ)鏈。它附著在引物上，然后沿 5' 到 3' 方向?qū)?DNA 堿基一一添加到單鏈上。
  
  結(jié)果是一條全新的 DNA 鏈和雙鏈 DNA 分子。
  
  此步驟的持續(xù)時(shí)間取決于被擴(kuò)增的 DNA 序列的長(zhǎng)度。復(fù)制 1,000 個(gè) DNA 堿基通常需要大約一分鐘。
  
  重復(fù)該過(guò)程
  
  這三個(gè)熱循環(huán)過(guò)程重復(fù) 20-40 次，以產(chǎn)生大量感興趣的 DNA 序列的副本。
  
  PCR 過(guò)程中產(chǎn)生的新 DNA 片段也可以作為 DNA 聚合酶可以附著并開(kāi)始產(chǎn)生 DNA 的模板。
  
  結(jié)果是在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量特定 DNA 片段的拷貝。
  
  檢測(cè)試劑盒PCR擴(kuò)增的原理和步驟介紹到這里。這些原理對(duì)于初次實(shí)驗(yàn)新手理解起來(lái)并非容易，要結(jié)合實(shí)驗(yàn)反復(fù)測(cè)試。如果有實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，歡迎前來(lái)交流！
  

  上海通蔚生物PCR試劑盒設(shè)計(jì)人性化，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜的前處理步驟，即可快速完成樣本的PCR擴(kuò)增。同時(shí)，試劑盒具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)DNA或RNA序列，為科研和診斷提供有力支持。