探針法 PCR 工作原理詳解：從熒光到基因定量

  上篇我們認(rèn)識(shí)qPCR，對(duì)比PCR之間區(qū)別，知道qPCR，你應(yīng)該接觸到染料法PCR和熒光探針法PCR。它們都屬于qPCR（實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)）。今天，主要講下探針法PCR工作原理，對(duì)探針法PCR有個(gè)全面的認(rèn)識(shí)。關(guān)于qPCR，可以參考《qPCR：實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)》

  什么是探針法PCR?

  探針法的qPCR是一種PCR方法，它使用熒光標(biāo)記的序列特異性DNA寡核苷酸（稱為探針）來獲得非常準(zhǔn)確和特異的結(jié)果。使用探針不僅需要設(shè)計(jì)引物，還需要設(shè)計(jì)探針（下文有介紹），這可能會(huì)使實(shí)驗(yàn)比使用基于染料的qPCR更加耗時(shí)和昂貴。

  探針法PCR是如何工作？

  再開始使用探針的qPCR，您需要的探針在其一端包含熒光報(bào)告染料，在另一側(cè)包含猝滅元件，通過吸收?qǐng)?bào)告基因發(fā)出的光來防止熒光。熒光報(bào)告染料和猝滅劑的位置彼此靠近，以便猝滅劑阻止熒光。在設(shè)計(jì)引物和探針時(shí)考慮引物和探針的位置也很重要。探針應(yīng)位于序列中間的引物之間。在PCR過程中，探針定位引物下游并與互補(bǔ)靶標(biāo)結(jié)合。然后，熒光報(bào)告染料和猝滅劑被TaqDNA聚合酶分離，該酶會(huì)裂解探針。這使得熒光信號(hào)被釋放，qPCR機(jī)器將測(cè)量該信號(hào)，然后用于定量樣品中的DNA量。（圖1）

圖1 TaqMan 探針法原理示意圖

  這種方法的好處是您可以確定信號(hào)來自預(yù)期目標(biāo)，因?yàn)橹挥幸锖吞结樑c正確的序列結(jié)合時(shí)您才能獲得信號(hào)。前提是探針和引物設(shè)計(jì)良好并且不會(huì)非特異性地結(jié)合到其他地方。

  除了更高的特異性（與基于染料的qPCR相比）之外，基于探針的qPCR還可以節(jié)省反應(yīng)完成后分析qPCR結(jié)果的時(shí)間，因?yàn)槟恍枰宄诓榭吹氖欠裾_目標(biāo)放大與否。由于探針的特異性，如果您沒有大量目標(biāo)材料或想要檢測(cè)目標(biāo)中的微小變化（如SNP（單核苷酸多態(tài)性）），它們也很有用。

  如前所述，基于探針的qPCR可用于多重檢測(cè)。這意味著通過使用攜帶不同報(bào)告染料的不同標(biāo)記探針可以在單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)序列。由于在不同通道中檢測(cè)到不同的熒光團(tuán)，因此稍后可以區(qū)分哪一個(gè)目標(biāo)被擴(kuò)增。與使用單重分析相比，這可以使實(shí)驗(yàn)更快、更便宜。盡管如此，重要的是要記住在混合物中添加更多的反應(yīng)組分或使用專為多重檢測(cè)而設(shè)計(jì)的指定試劑，這樣就不會(huì)出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)，從而限制一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)的擴(kuò)增。

  如何設(shè)計(jì)探針？

  探針法PCR最困難的部分可能是設(shè)計(jì)探針。一旦完成，其他一切實(shí)際上與基于染料的qPCR（后期要討論的）沒有什么不同。

  當(dāng)開始設(shè)計(jì)探針時(shí)，明智的做法是同時(shí)記住引物，以避免自我互補(bǔ)并確保其對(duì)靶標(biāo)的特異性。運(yùn)行BLAST比對(duì)很可能會(huì)對(duì)此有所幫助。您還可以嘗試其他軟件，如SnapGene、Benchling等。探針的位置應(yīng)靠近引物（約50bp），但不能重疊。應(yīng)以中等量（~50%）的GC含量為目標(biāo)，以允許復(fù)雜性，同時(shí)保持獨(dú)特的序列。此外，探針不應(yīng)太長(zhǎng)（~30bp），否則將難以正確猝滅熒光。探針的熔解溫度應(yīng)略高于引物(8-10°C)，以確保更好的靈敏度。在循環(huán)程序中，退火溫度應(yīng)設(shè)置為比引物熔解溫度下限低最多5°C，以實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合。大多數(shù)探針設(shè)計(jì)程序也會(huì)告訴您要記住這些建議，但根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同，可能需要進(jìn)行優(yōu)化。

  在計(jì)劃多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，設(shè)計(jì)帶有報(bào)告熒光團(tuán)的探針非常重要，這些熒光團(tuán)具有足夠不同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，以便qPCR機(jī)器可以區(qū)分它們。猝滅劑還必須與報(bào)告基因相匹配。此外，請(qǐng)確保您的qPCR機(jī)器實(shí)際上能夠讀取所有熒光團(tuán)信號(hào)，以及您是否擁有無ROX、高ROX或低ROX機(jī)器。

最后您應(yīng)該知道qPCR有不同的探針變體，這些變體也有變體，這些變體有修改，所以確實(shí)有很多選項(xiàng)可供選擇。最流行的是水解探針（例如TaqMan®），它們有利于定量和多重分析。然后還有分子信標(biāo)，它們被認(rèn)為更具特異性，可用于SNP檢測(cè)等。

上述是探針法 PCR 工作原理詳解，內(nèi)容比較多和抽象，大家看完文章后可以對(duì)照自己的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作，通過實(shí)驗(yàn)加深原理的理解。如果對(duì)探針法PCR還有疑問，可以尋求在線技術(shù)顧問幫助。如果您想了解更多探針法PCR試劑盒，歡迎前來咨詢。