詳解細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)：從準(zhǔn)備到完成的全程步驟

  細(xì)胞為什么傳代？如果繼續(xù)在同一容器中培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)密度會(huì)逐漸增加，導(dǎo)致細(xì)胞老化和細(xì)胞死亡。為了防止這種情況，將少量細(xì)胞移植到另一個(gè)容器中的過(guò)程稱(chēng)為“傳代”。

 

  傳代程序根據(jù)細(xì)胞的性質(zhì)略有不同，因此請(qǐng)務(wù)必檢查哪種方法適合您正在處理的細(xì)胞。在本文中，我們將解釋三種模式的傳代程序：貼壁細(xì)胞、抗貼壁細(xì)胞和浮動(dòng)細(xì)胞。

 

  貼壁細(xì)胞的傳代

 

  首先，我們來(lái)談?wù)勅绾蝹鞔N壁細(xì)胞。貼壁細(xì)胞在體外生長(zhǎng)，直到培養(yǎng)容器的表面被細(xì)胞覆蓋或直到培養(yǎng)基耗盡營(yíng)養(yǎng)。最好在細(xì)胞增殖到這種程度之前進(jìn)行傳代。

 

  為了傳代細(xì)胞，首先將它們重組成懸浮液。盡管細(xì)胞附著程度因每個(gè)細(xì)胞系而異，但通常使用胰蛋白酶等蛋白酶將細(xì)胞從培養(yǎng)容器中分離出來(lái)。然而，這種方法可能并不適合所有細(xì)胞系，因?yàn)榈鞍酌缚赡軙?huì)干擾某些細(xì)胞系，或者酶可能會(huì)消化感興趣的膜標(biāo)記物或受體蛋白。在這種情況下，另一種方法是用細(xì)胞刮刀等物理刮除細(xì)胞并將其添加到少量培養(yǎng)基中以產(chǎn)生懸浮液。

 

  貼壁細(xì)胞傳代步驟

 

  步驟一：檢查細(xì)胞狀態(tài)

 

  步驟二：從容器中取出介質(zhì)

 

  步驟三：用PBS(-)清洗（必要時(shí)重復(fù)）

 

  步驟四：添加胰蛋白酶/EDTA

 

  步驟五：孵育2-10分鐘

 

  步驟六：檢查細(xì)胞狀態(tài)

 

  步驟七：添加新鮮培養(yǎng)基并懸浮

 

  步驟八：在裝有溫?zé)崤囵B(yǎng)基的培養(yǎng)容器中播種

 

  步驟久放入培養(yǎng)箱中

 

  所需設(shè)備和試劑如下

 

  1、將培養(yǎng)基加熱至37°C（或細(xì)胞隨附的ECACC細(xì)胞系數(shù)據(jù)表上推薦的溫度）

 

  2、70%乙醇

 

  3、PBS(-)（不含Ca 2+/Mg 2+的PBS）

 

  4、0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液

 

  5、胰蛋白酶抑制劑

 

  6、臺(tái)盼藍(lán)

 

  7、孵化器

 

  8、培養(yǎng)容器和標(biāo)簽

 

  9、倒置顯微鏡、相差顯微鏡

 

  10、離心機(jī)

 

  11、血球計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）

 

  12、記號(hào)筆

 

  13、移液器

 

  14、用于放置小瓶的架子

 

  如何傳代貼壁細(xì)胞

 

  下面我們就來(lái)看看具體的步驟吧。

 

  步驟一、檢查細(xì)胞狀態(tài)

 

  使用顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)（沒(méi)有細(xì)菌或真菌等污染物）和匯合度（大約匯合度的百分比）。

 

  步驟二、從容器中取出介質(zhì)

 

  打開(kāi)抽吸器，用移液器吸取培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基并丟棄。吸取培養(yǎng)基時(shí)，稍微傾斜容器，從最深處吸取液體。最好從盡可能靠近培養(yǎng)皿或燒瓶側(cè)面的地方吸起。

 

 

  步驟三、用PBS清洗細(xì)胞

 

  用培養(yǎng)用大約一半體積的PBS(-)（不含Ca 2+/Mg 2+的PBS）清洗細(xì)胞表面。如果細(xì)胞牢固附著，請(qǐng)重復(fù)幾次。

 

  步驟四、添加胰蛋白酶/EDTA

 

  將1 mL胰蛋白酶/EDTA添加到25 cm的細(xì)胞表面進(jìn)行清洗。緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器，使胰蛋白酶均勻分布在細(xì)胞表面，然后丟棄多余的胰蛋白酶。

 

  步驟五、孵化

 

  將培養(yǎng)容器放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至10分鐘。

 

  步驟六、檢查細(xì)胞狀態(tài)

 

  在顯微鏡下觀察細(xì)胞并確認(rèn)細(xì)胞開(kāi)始漂浮。如有必要，用手指輕輕敲擊培養(yǎng)容器的側(cè)面以松開(kāi)任何卡住的細(xì)胞。

 

  步驟七、添加新鮮培養(yǎng)基并懸浮

 

  將細(xì)胞重懸于含有少量血清的培養(yǎng)基中以滅活胰蛋白酶。但是，請(qǐng)注意，如果您使用無(wú)血清培養(yǎng)基，則需要使用胰蛋白酶抑制劑滅活胰蛋白酶。從懸浮液中取出約100-200μL，用臺(tái)盼藍(lán)等染色，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

 

  步驟八、在裝有溫?zé)崤囵B(yǎng)基的培養(yǎng)容器中播種

 

  用溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基填充新標(biāo)記的培養(yǎng)容器并轉(zhuǎn)移所需量的細(xì)胞。（請(qǐng)以ECACC細(xì)胞系數(shù)據(jù)表上記載的適量為標(biāo)準(zhǔn)。）

 

  步驟九、放入培養(yǎng)箱中

 

  在數(shù)據(jù)表中指定的適當(dāng)條件下孵育細(xì)胞。

 

  根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況重復(fù)上述步驟。

 

  貼壁細(xì)胞傳代技巧

 

  執(zhí)行此操作時(shí)需要記住幾點(diǎn)。首先，根據(jù)某些細(xì)胞系的生長(zhǎng)水平，它們可能會(huì)輕微粘附在表面并容易脫落。經(jīng)常檢查培養(yǎng)容器內(nèi)的條件，注意不要在細(xì)胞尚未成熟時(shí)使細(xì)胞脫落。

 

  在步驟3中，用PBS(-)沖洗細(xì)胞表面，去除培養(yǎng)基中含有的血清。此步驟非常重要，因?yàn)橐鹊鞍酌冈谘宕嬖谙虏痪哂谢钚浴?/span>

 

  當(dāng)對(duì)細(xì)胞使用胰蛋白酶/EDTA時(shí)，請(qǐng)使用分離細(xì)胞所需的最短處理時(shí)間。長(zhǎng)時(shí)間接觸可能會(huì)損害細(xì)胞表面受體。非酶細(xì)胞分離劑（例如胰蛋白酶）也可用于分離細(xì)胞。建議在必要時(shí)使用它，例如當(dāng)您想在溫和的條件下去角質(zhì)時(shí)。

 

  將新細(xì)胞接種到培養(yǎng)容器中時(shí)，除非用血清中和胰蛋白酶，否則細(xì)胞不會(huì)粘附。除了使用血清外，胰蛋白酶抑制劑（例如源自大豆的抑制劑）也可用于中和胰蛋白酶。在這種情況下，首先將等體積的胰蛋白酶抑制劑（濃度1 mg/mL）添加到待中和的懸浮液中。然后，離心混合物，棄去上清液，并重懸于新鮮培養(yǎng)基中。當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，該過(guò)程特別有效。

 

  如果沒(méi)有CO 2培養(yǎng)箱，則用含有0.2μm過(guò)濾滅菌的5%CO 2空氣進(jìn)行氣體交換1-2分鐘。

 

  如果收獲的細(xì)胞密度不夠，以150 x g離心5分鐘，然后重懸于少量培養(yǎng)基中。

 

  半貼壁細(xì)胞的傳代

 

  根據(jù)細(xì)胞系的類(lèi)型，所有細(xì)胞可能不會(huì)粘附在培養(yǎng)容器上，并且可能部分培養(yǎng)為懸浮液。這些細(xì)胞必須傳代以維持其細(xì)胞狀態(tài)。

 

  所需的一般流程、設(shè)備和試劑與貼壁細(xì)胞相同，但詳細(xì)步驟有所不同。

 

  一、檢查細(xì)胞狀態(tài)

 

  使用顯微鏡觀察細(xì)胞的狀態(tài)（沒(méi)有細(xì)菌或真菌等污染物）和匯合度（大約匯合度的百分比）。此時(shí)，如果通過(guò)敲擊或搖動(dòng)培養(yǎng)容器的側(cè)面將細(xì)胞從培養(yǎng)容器中提起，則不再需要胰蛋白酶處理。

 

  二、從容器中取出介質(zhì)

 

  用移液器去除含有非貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基。不要丟棄該介質(zhì)，而是將其保存在無(wú)菌離心管中。

  三、用PBS清洗細(xì)胞

 

  對(duì)于培養(yǎng)容器表面上剩余的每25 cm2細(xì)胞，用1-2 mL PBS(-)清洗細(xì)胞表面。將洗滌后的PBS(-)保存在單獨(dú)的管中。

 

  四、添加胰蛋白酶/EDTA

 

  用1 mL胰蛋白酶-EDTA清洗25 cm的細(xì)胞單層表面。緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器，使胰蛋白酶遍布細(xì)胞表面，然后丟棄多余的胰蛋白酶。

 

  五、孵化

 

  將培養(yǎng)容器放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至10分鐘。

  六、檢查細(xì)胞狀態(tài)

 

  在顯微鏡下觀察細(xì)胞并確認(rèn)細(xì)胞開(kāi)始漂浮。如有必要，用手指輕輕敲擊培養(yǎng)容器的側(cè)面以松開(kāi)任何卡住的細(xì)胞。

 

  七、添加新鮮培養(yǎng)基并懸浮

 

  將提起的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加入保留的培養(yǎng)基，并將整個(gè)懸浮液以150×g離心5分鐘。棄去上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于少量新鮮培養(yǎng)基（10-20 mL）中，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

 

  八、將細(xì)胞接種到新容器中

 

  將所需量的細(xì)胞放入新的培養(yǎng)容器中，并用新鮮培養(yǎng)基稀釋至所購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞數(shù)據(jù)表上建議的細(xì)胞密度。

 

  每2-3天重復(fù)一次上述步驟。

 

  基本的預(yù)防措施與貼壁細(xì)胞的預(yù)防措施沒(méi)有太大區(qū)別。

  大多數(shù)細(xì)胞被胰蛋白酶分離，但通過(guò)添加EDTA可以進(jìn)一步增強(qiáng)效果。

 

  胰蛋白酶在血清存在下不具有活性。因此，在步驟3中，與貼壁細(xì)胞一樣，通過(guò)用PBS(-)沖洗細(xì)胞表面來(lái)除去培養(yǎng)基中含有的血清。反復(fù)加熱至37度也可能導(dǎo)致胰蛋白酶活性下降。

 

  此外，當(dāng)對(duì)細(xì)胞使用胰蛋白酶-EDTA時(shí)，處理時(shí)間應(yīng)保持最短，就像貼壁細(xì)胞一樣。對(duì)于半貼壁細(xì)胞，接觸胰蛋白酶的時(shí)間比正常貼壁細(xì)胞短得多。

 

  將新細(xì)胞接種到培養(yǎng)容器中時(shí)，除非用血清中和胰蛋白酶，否則細(xì)胞不會(huì)粘附。除了使用血清外，胰蛋白酶抑制劑（例如源自大豆的抑制劑）也可用于中和胰蛋白酶。

 

  如果沒(méi)有CO 2培養(yǎng)箱，則用含有0.2μm過(guò)濾滅菌的5%CO 2空氣進(jìn)行氣體交換1-2分鐘。

 

  浮游細(xì)胞的傳代

 

  大多數(shù)浮游細(xì)胞是血細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞（淋巴細(xì)胞等），并在懸浮液中培養(yǎng)。這些細(xì)胞可以作為單個(gè)細(xì)胞或成簇生長(zhǎng)（例如，EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞）。這種類(lèi)型可以通過(guò)稀釋培養(yǎng)相對(duì)容易地傳代。然而，在某些情況下，例如形成團(tuán)塊的細(xì)胞系，必須將細(xì)胞離心至單個(gè)細(xì)胞，然后在計(jì)數(shù)前重新懸浮。

 

  首先，讓我們檢查一下總體流程。請(qǐng)注意，僅當(dāng)步驟3適用時(shí)才會(huì)執(zhí)行標(biāo)有星號(hào)(*)的步驟。

 

  1、檢查細(xì)胞狀態(tài)

 

  2、（150×g離心5分鐘）*

 

  3、（在新鮮培養(yǎng)基中添加約10-20%的條件培養(yǎng)基）*

 

  4、采集細(xì)胞樣本

 

  5、測(cè)量細(xì)胞密度，稀釋至適當(dāng)密度，并懸浮在新培養(yǎng)基中。

 

  6、每2-3天重復(fù)一次上述操作

 

  所需設(shè)備和試劑如下

 

  1、將培養(yǎng)基加熱至37°C（或細(xì)胞隨附的ECACC細(xì)胞系數(shù)據(jù)表上推薦的溫度）

 

  2、70%乙醇

 

  3、臺(tái)盼藍(lán)

 

  4、孵化器

 

  5、培養(yǎng)容器和標(biāo)簽

 

  6、倒置顯微鏡、相差顯微鏡

 

  7、離心機(jī)

 

  8、血球計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）

 

  9、記號(hào)筆

 

  10、移液器

 

  11、用于放置小瓶的架子

 

  如何傳代浮游細(xì)胞

 

  現(xiàn)在，我們就來(lái)看看具體的步驟。為了避免對(duì)細(xì)胞造成壓力，該方案建議通過(guò)將細(xì)胞添加到新的培養(yǎng)基中并傳代來(lái)稀釋細(xì)胞。另一種方法是離心，除去上清液，然后將細(xì)胞重懸于新鮮培養(yǎng)基中。

 

  一、檢查細(xì)胞狀態(tài)

 

  在顯微鏡下檢查細(xì)胞的狀態(tài)。如果細(xì)胞呈圓形、明亮且反光，則處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。這時(shí)我們還要檢查是否有細(xì)菌、霉菌等污染物。

 

  二、分散細(xì)胞

 

  對(duì)于容易粘附在培養(yǎng)容器上的細(xì)胞，例如雜交瘤，可通過(guò)輕輕敲擊容器將其去除，或使用橡皮警察將其從容器中去除?；蛘?，通過(guò)移液分散細(xì)胞。這是因?yàn)?/span>EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可能形成單個(gè)大團(tuán)塊，從而難以對(duì)中心的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

 

  如何從過(guò)度生長(zhǎng)中恢復(fù)

 

  如果更換前的培養(yǎng)基顏色呈酸性（含有酚紅的培養(yǎng)基變黃），則細(xì)胞可能已經(jīng)過(guò)度生長(zhǎng)，恢復(fù)可能很困難。在這種情況下，可以通過(guò)以下方式進(jìn)行恢復(fù)：以150 x g離心約5分鐘，以比所附數(shù)據(jù)表中推薦濃度稍高的細(xì)胞密度接種到新培養(yǎng)基中，并添加約10至20%的條件培養(yǎng)基。。

 

  1、采集細(xì)胞樣本并進(jìn)行計(jì)數(shù)

 

  從細(xì)胞懸浮液中取出少量（100-200μL），用臺(tái)盼藍(lán)染色，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算每毫升的細(xì)胞數(shù)，將所需量放入新的培養(yǎng)容器中，并用新培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞隨附的數(shù)據(jù)表上推薦的細(xì)胞濃度。

 

  每2-3天重復(fù)一次上述步驟。

 

  如果培養(yǎng)的細(xì)胞系是雜交瘤或產(chǎn)生重組蛋白或生長(zhǎng)因子的細(xì)胞，則傳代后的舊培養(yǎng)基也應(yīng)保留以供以后分析。

 

  步驟3中使用的條件培養(yǎng)基也稱(chēng)為條件培養(yǎng)基。指細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間（數(shù)小時(shí)至數(shù)天）后收集的培養(yǎng)上清液。含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附因子、細(xì)胞毒性中和因子等，可能有助于細(xì)胞增殖和功能表達(dá)。

 

  上面，我們已經(jīng)解釋了細(xì)胞傳代的步驟。除了細(xì)胞類(lèi)型之外，不同的細(xì)胞系可能需要不同的程序和條件。實(shí)際使用細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)務(wù)必仔細(xì)閱讀細(xì)胞附帶的數(shù)據(jù)表，并在處理細(xì)胞時(shí)參考文獻(xiàn)。