ELISA檢測試劑盒：原理、步驟和操作指南

  elisa檢測試劑盒簡稱“酶聯(lián)免疫試劑盒”簡稱，它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。1971年– PeterPerlman和EvaEngvall開發(fā)了一種革命性的方法，稱為ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）。ELISA技術(shù)自七十年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前廣泛生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。

  如今elisa檢測試劑盒具有 靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、安全性及經(jīng)濟(jì)性等受到科研好評。接下來上海通蔚帶大家詳細(xì)了解一下elisa實(shí)驗(yàn)原理及步驟。

  ELISA原理

  酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是一種使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定的免疫測定法，用于檢測和定量生物分子，例如抗體、蛋白質(zhì)、激素或肽，以及表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-核酸相互作用。

  在ELISA實(shí)驗(yàn)中，用于實(shí)驗(yàn)的靶標(biāo)（如抗原）固定在固體表面上，然后使用辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的酶綴合抗體進(jìn)行檢測。通過與被酶催化的底物孵育來實(shí)現(xiàn)定量，從而產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。

  由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。目前，elisa試劑盒檢測方法有直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA 和競爭 ELISA 等。

  直接ELISA法

  在直接ELISA中，抗原通過被動(dòng)吸附直接固定在板（聚苯乙烯微孔板上）的表面，然后使用蛋白質(zhì)（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA或任何其他動(dòng)物蛋白）封閉微孔板，洗滌板并與一抗一起孵育。并使用HRP標(biāo)記的一抗進(jìn)行檢測。將無色底物引入樣品，該底物與酶結(jié)合物反應(yīng)，并產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。該副產(chǎn)物可以是比色的，化學(xué)發(fā)光的或熒光的。

圖1 直接ELISA

  由于elisa直接法步驟較少，適用于實(shí)驗(yàn)室工作流程的快速技術(shù)，同時(shí)還消除了二抗交叉反應(yīng)，其缺點(diǎn)是靈敏度較低，成本較高。

  間接ELISA法

  間接ELISA法是在直接ELISA上改進(jìn)的版本。在間接ELISA中，用于檢測抗原的一抗是未偶聯(lián)的。間接ELISA工作流程要涉及到兩種類型抗體：一抗和二抗。取而代之的是，對一抗的宿主物種具有反應(yīng)性的酶標(biāo)二級(jí)抗體被用于檢測一抗-抗原復(fù)合物（間接檢測抗原）。將無色底物引入樣品，該底物與酶結(jié)合物反應(yīng)，并產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇，該副產(chǎn)物可以是比色的，化學(xué)發(fā)光的或熒光的。

圖2 間接ELISA

  間接ELISA的優(yōu)點(diǎn)是成本較低、更加靈敏和靈活。然而，由于二抗的存在，檢測過程中存在交叉反應(yīng)的可能性。

  夾心ELISA法

夾心elisa法也叫“三明治法”，它需要使用匹配的抗體對，從而每種抗體對抗原上不同的非重疊表位具有特異性。首先將一種抗體，稱為捕獲抗體，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促進(jìn)靶抗原的固定。然后，第二種抗體（稱為檢測抗體）與捕獲抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合。最后，添加對檢測抗體（而非捕獲抗體）具有特異性的酶標(biāo)記的第二抗體偶聯(lián)物。

圖3 夾心ELISA

  夾心ELISA具有最高的靈敏度，但其主要缺點(diǎn)是該過程所需的時(shí)間和費(fèi)用。此外，尋找完美抗原抗體對的必要性也是該測定的限制。

  競爭ELISA法

  競爭elisa法檢測樣品中抗原特異性抗體的存在。將特異性抗體吸附于固相載體，加入待測抗原（標(biāo)準(zhǔn)品或樣本）和生物素標(biāo)記的檢測抗原，二者競爭與固相抗體結(jié)合，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，經(jīng)過溫育和徹底洗滌后加入顯色底物。顯色的深淺與樣品中待測物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。

  競爭elisa法不能用于經(jīng)過任何程度稀釋的樣品，并且靈敏度較低。然而，它有許多優(yōu)點(diǎn)，例如需要較少的樣品純化、較小的變異性以及分析樣品中的一系列抗原。

  Elisa檢測試劑盒組成及選擇

  Elisa檢測試劑盒組成

  Elisa檢測試劑盒組成通常包含酶標(biāo)板（Microplate）、標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）、生物素標(biāo)記的檢測抗體(DetectedAntibody)、洗滌液(WashingBuffer)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)和顯色底物(TMB)。

圖4 elisa試劑盒組成

  Elisa檢測試劑盒選擇

  ELISA實(shí)驗(yàn)的成敗，很大程度上取決于試劑盒的選擇。面對眾多品牌和種類，如何挑選合適的試劑盒呢？以下六個(gè)關(guān)鍵要素為你指明方向：

  1、供應(yīng)種屬

  一個(gè)ELISA試劑盒，多個(gè)種屬，如果您需對不同物種的同一因子進(jìn)行定量，建議優(yōu)先尋找適用于多個(gè)種屬的ELISA試劑盒，產(chǎn)品屬性說明中會(huì)注明。Elis試劑盒種屬有羊、雞、鴨、人、大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠、兔子、豬、犬、猴、馬、牛等動(dòng)物。

  2、明確樣本的類型

  首先，您需要確定要檢測的分析物的樣本的類型。夾心ELISA最適合檢測具有眾多表位的巨大蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞因子。而競爭性ELISA主要用于檢測小分子，例如半抗原。

  大多數(shù)市售ELISA試劑盒均已在培養(yǎng)物上清液和血清/血漿上進(jìn)行了驗(yàn)證。正確閱讀產(chǎn)品說明和說明非常重要。這確保了該試劑盒適合需要分析的樣品。

  血漿樣本的采集方式會(huì)極大地影響試劑盒類型的選擇，進(jìn)而影響所獲得的結(jié)果。

  其他因素，例如溶血和樣品制備中存在的脂質(zhì)，可能會(huì)影響測定性能。在選擇ELISA試劑盒之前，請確保充分注意這些因素。

  抗體類型

  您可以聯(lián)系ELISA試劑盒供應(yīng)商，獲取有關(guān)試劑盒中使用的抗體類型的信息。它將幫助您確定它是單克隆抗體還是多克隆抗體。對于夾心ELISA，使用多克隆抗體捕獲抗體和使用單克隆抗體檢測抗體是有益的。

  線性和回收率實(shí)驗(yàn)

  您可以進(jìn)行回收率和線性實(shí)驗(yàn)來監(jiān)測ELISA試劑盒的性能?；厥章蕼y試分析樣品基質(zhì)中存在的變化對分析物檢測的影響。據(jù)觀察，如果該值較高，則恢復(fù)效果更好。

  稀釋線性分析特定稀釋劑中分析物的劑量響應(yīng)線性。在理想情況下，所有稀釋度的樣品濃度都是相同的。

  很多時(shí)候，供應(yīng)商在產(chǎn)品規(guī)格中給出了回收率和線性數(shù)據(jù)。除此之外，為了更清楚起見，還提到了其他關(guān)鍵參數(shù)，例如動(dòng)態(tài)范圍和靈敏度。不同制造商提供的ELISA試劑盒可能具有不同的數(shù)據(jù)參數(shù)。要選擇合適的ELISA試劑盒，您可以分析所有數(shù)據(jù)參數(shù)，尤其是線性和回收率數(shù)據(jù)。

  系統(tǒng)所用檢測范圍

  ELISA中可用的各種檢測系統(tǒng)包括比色法、發(fā)光法和熒光法。所有ELISA試劑盒都包括一定水平的分析物阻塞，包括應(yīng)用酶標(biāo)記和類似底物。選擇合適的酶和相同的底物至關(guān)重要。此外，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇交叉反應(yīng)的酶底物、檢測設(shè)備和微孔板。

  文獻(xiàn)引用數(shù)

  好的產(chǎn)品，肯定經(jīng)得起廣大科研工作者的檢驗(yàn)，ELISA試劑盒文獻(xiàn)引用特別是高質(zhì)量的SCI文章的引用是很多人都關(guān)心的問題，這是業(yè)界對產(chǎn)品認(rèn)可的一個(gè)非常重要指標(biāo)，而且對相關(guān)用戶的科研有一定的借鑒作用。

  Elisa檢測試劑盒基本步驟

  Elisa檢測試劑盒基本步驟分包被、溫育、洗滌和測量，詳細(xì)如下：

  包被酶標(biāo)板。將酶標(biāo)板（微孔板）的孔位用特定的抗體或抗原進(jìn)行包被，以便后續(xù)的檢測。

  加樣。將標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品加入酶標(biāo)板的孔中。這可能包括稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。在加樣時(shí)，應(yīng)避免觸及孔壁，并輕輕晃動(dòng)混勻。

  溫育。用封板膜封閉酶標(biāo)板后，將其放置在特定溫度下進(jìn)行溫育，以便樣本與孔內(nèi)的抗體或抗原充分反應(yīng)。

  洗滌。溫育后，用洗滌液徹底清洗孔位，去除未結(jié)合的物質(zhì)。

  加酶標(biāo)記抗體。向孔中加入與待測物質(zhì)結(jié)合的酶標(biāo)記抗體，形成免疫復(fù)合物。

  再次洗滌。去除未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體。

  顯色和終止反應(yīng)。加入底物溶液使酶標(biāo)記抗體產(chǎn)生顯色或熒光反應(yīng)。隨后加入停止液以停止反應(yīng)。

  測量。使用酶標(biāo)儀或熒光分析儀測量各孔的信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度確定待測物質(zhì)的濃度。

  常用的ELISA檢測方法

  在ELISA中，經(jīng)常使用與特定抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體。因此，當(dāng)將能夠轉(zhuǎn)化酶的底物添加到反應(yīng)混合物中時(shí)，會(huì)引起溶液顏色的變化。使用檢測方法來檢測或分析信號(hào)。

  根據(jù)酶和底物的不同，ELISA檢測中的檢測方法差異很大。如今，還有許多ELISA試劑盒可讓您輕松進(jìn)行ELISA測定。但是，它不包含執(zhí)行檢測所需的通用試劑，例如tween-20、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、封閉緩沖液、洗滌緩沖液等。

  目前有許多檢測方法可用于研究抗原抗體復(fù)合物之間的反應(yīng)，例如比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法和顯色法。然而，下面介紹了其中最常見的三種。

  化學(xué)發(fā)光分析

  該技術(shù)利用過氧化物酶偶聯(lián)的檢測抗體，例如HRP和AP。基于魯米諾的溶液用作形成反應(yīng)產(chǎn)物的底物，發(fā)射光子，可以使用光度計(jì)讀取光子。

  與其他檢測方法相比，該技術(shù)具有超靈敏性，具有更寬的動(dòng)態(tài)范圍，甚至可以檢測給定樣品中最少量的分析物。

  顯色測定

  顯色法是ELISA檢測方法中最常見的類型之一。它涉及使用辣根過氧化物酶(HRP-)或堿性磷酸酶(AP-)標(biāo)記的抗體與顯色底物（例如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液）結(jié)合使用。

  該技術(shù)利用反應(yīng)的吸光度來確定讀數(shù)，用于比較樣品或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測感興趣分子的濃度。

  熒光分析

  該技術(shù)將過氧化物酶偶聯(lián)的檢測抗體（例如HRP和AP）與暴露于某些光波長時(shí)發(fā)出熒光的熒光底物相結(jié)合。即使分析物濃度較高，信號(hào)也不會(huì)飽和，并提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。

  上述為大家介紹了elisa檢測試劑盒原理和步驟，具體操作步驟要結(jié)合自己的實(shí)驗(yàn)需求和說明進(jìn)行操作。由于ELISA方法具有敏感、快速、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于檢測中，對于科研，了解和操作ELISA實(shí)驗(yàn)是非常重要的。