分子生物學實驗基礎：掌握滅菌技術

  什么是滅菌？滅菌是指"殺死或完全除去所有生物體"，是分子生物學實驗中最重要的操作之一。在培養(yǎng)大腸桿菌或無菌培養(yǎng)細胞/組織之前，請檢查是否被培養(yǎng)的生物體以外的微生物（例如細菌、酵母、霉菌、支原體）污染以及細胞之間的污染（交叉污染）。使用的介質、試劑和設備應盡可能無菌。此外，從分子生物學的角度來看，滅菌預計具有使受污染的DNA和RNA變性和降解、以及使溶核酶失活的作用。通過滅菌殺死或除去微生物的狀態(tài)稱為“無菌”，維持這種狀態(tài)稱為無菌操作。

  

 
 滅菌方法大致可分為使用熱的方法和不使用熱的方法：

  最熟悉和可靠的方法是使用熱量。例如，使用電烤箱的干熱滅菌、用火焰加熱金屬等的火焰滅菌、以及使用高壓蒸汽的高壓滅菌器（高壓蒸汽滅菌）。

  RNase對試劑和設備的污染是涉及RNA的實驗中的一個問題，因此需要提供無RNase的環(huán)境，這意味著RNase被完全失活并去除。干熱滅菌和火焰滅菌可以可靠地去除 RNase，但要小心，因為高壓滅菌可能會留下少量 RNase。

  另一方面，使用膜過濾器過濾滅菌是不使用加熱而物理去除微生物的常用方法，但由于核酸和病毒會通過過濾器，因此必須小心。此外，作為超出實驗室水平的方法，還有伽馬射線滅菌和氣體滅菌（環(huán)氧乙烷氣體），用于對一次性塑料器械和醫(yī)院進行滅菌。

  本文對實驗室常用的滅菌方法干熱滅菌、高壓滅菌、火焰滅菌、過濾滅菌進行概述、特點及注意事項。

  干熱滅菌

  干熱滅菌是使用電烘箱的滅菌方法，推薦加熱條件為160-170℃120分鐘、170-180℃60分鐘、180-190℃30分鐘。為了徹底去除 RNase，加熱 2-3 小時是安全的。

  用于對玻璃、金屬儀器等可加熱至高溫的物品以及不宜與蒸汽接觸的物品進行滅菌。瓶蓋通常不能干熱滅菌，但可以使用杜蘭瓶紅色瓶蓋。

  將移液器放入移液器罐中，用鋁箔包裹玻璃器皿、研缽、攪拌棒、抹刀等，然后放入烤箱中。此時，請務必將設備徹底干燥后再插入，以免出現(xiàn)水滴。另外，請確保在烤箱中留出足夠的空間，以便熱量均勻地施加到電器上。加熱器附近的金屬部件可能會比設定溫度更熱，因此請避免在附近放置棉塞等易燃物品。打開開關并測量箱體達到指定溫度后的時間。滅菌完成后，關閉加熱器并等待冰箱內部充分冷卻后再取出物品。

  高壓滅菌器滅菌

  高壓滅菌器（高壓蒸汽滅菌器/高壓滅菌器）是一種結構類似于巨大壓力鍋的設備，它可以通過施加壓力來提高水的沸點，并利用高溫蒸汽進行熱處理。這種熱處理有時稱為高壓釜。水的沸點在1個大氣壓下為100°C，但在2個大氣壓下則變?yōu)榧s121°C。典型的高壓滅菌包括在121℃下熱處理15至20分鐘。

  使用它不需要特殊的資格或許可證，但由于它被歸類為小型壓力容器，因此請小心處理。

  可高壓滅菌的儀器和溶液在高達 130°C 的溫度下保持穩(wěn)定，并且可以受潮。主要用于對干熱滅菌溫度（160°C或更高）敏感的橡膠儀器、玻璃儀器、耐熱塑料儀器、金屬、耐高壓滅菌介質以及不發(fā)生熱變性的試劑的滅菌。水溶液可以高壓滅菌，但有機溶劑不應高壓滅菌。

  為防止高壓滅菌器內部污染，建議用于廢物處理的高壓滅菌器與用于滅菌的高壓滅菌器分開安裝，即使使用相同的設備，廢物處理和滅菌也應分開進行。經常清潔用于滅菌的高壓滅菌器，并且當有液體可能溢出到滅菌室時務必進行清潔。

  高壓滅菌器滅菌程序

  首先，加入自來水，直到瀝水板（底部有孔的圓盤）稍微浸沒。此時，如果添加超純水，電流就不容易流動，防干燒機制可能會被激活。將儀器和試劑從上方放入籃子中。將蓋子放在正確的位置并擰緊手柄以將其固定。確保安全閥的重量放置正確，關閉排氣旋塞，設定定時器，然后開始加熱。

  隨著設備內部溫度逐漸升高，蒸汽會從排氣軟管中冒出，但一段時間后閥門會自動關閉，內部壓力會增加。若有蒸汽泄漏，將蓋子稍微擰緊，若仍不停止，則停止操作。運行中請勿移動設備，若安全閥的重物因振動而脫落，請用鑷子等夾起重物，重新放置。

  經過設定時間后，溫度和內部壓力逐漸降低，在100℃左右排氣閥打開。當壓力達到常壓且溫度降至100℃以下時，打開蓋子，取出儀器和試劑，直至其冷卻到可以容納的程度。

  用于精確測量少量量的微量移液器吸頭應在使用前在高壓滅菌器中消毒并干燥。

  通過高壓滅菌對液體進行滅菌時

  將液體放入玻璃容器中并進行高壓滅菌。此時，您可以在打開（松開）蓋子的情況下進行操作，也可以在關閉蓋子的情況下進行操作。

  如果蓋子打開，任何普通耐熱玻璃容器都可以使用，但存在污染樣品的潛在風險，以及揮發(fā)性物質（鹽酸、乙酸、氨、碳酸、缺點是一些鹽（例如，鹽）通過蒸發(fā)而損失。如果用鋁箔蓋住容器的蓋子，加熱后即可關閉，無需直接接觸蓋子。如果在瓶子很熱時蓋上蓋子，瓶子內部會形成負壓，蓋子將無法打開，因此請在蓋上蓋子之前讓其充分冷卻。

  液體培養(yǎng)基的滅菌也在開放系統(tǒng)中完成。蓋子使用鋁箔、硅膠泡沫塞、棉塞以及試劑瓶上的活蓋?；旧?，按照與普通溶液相同的方式進行，高壓滅菌后，確保蓋子蓋緊，然后存放在陰涼、黑暗的地方。

  對瓊脂培養(yǎng)基進行高壓滅菌時，添加粉末狀的瓊脂，然后將瓊脂溶解在高壓滅菌器中。高壓滅菌后，濃稠的瓊脂溶液會沉淀在底部，因此用手搖晃使其均勻。一旦容器冷卻至 45-55°C，根據需要無菌添加不耐熱添加劑（抗生素、IPTG 等）和高壓滅菌后添加的鹽（鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽等）。如果不立即使用，請在 45-55°C 下保溫。

  對容器進行高壓滅菌時，請務必使用壓力瓶。帶藍色瓶蓋（或同等瓶蓋）的杜蘭德瓶是不錯的選擇。但如果大于1升，則需要小心，因為它很容易損壞。向瓶子中添加的液體不要超過規(guī)定量，添加碳酸氫鈉時，將液體量限制在瓶子的一半左右。

  對溶液進行高壓滅菌時，應注意以下幾點，防止發(fā)生事故。首先，不要向鍋中注入超過其容量35%的液體。鍋在操作過程中可能會爆炸。另外，高壓滅菌后，不要強行排氣，讓壓力和溫度自然下降，待充分冷卻后再取出。當溶液溫度超過100℃時，如果打開、關閉蓋子或振動，可能會發(fā)生暴沸。特別是如果含有瓊脂，則很難冷卻，更容易發(fā)生這種事故。

  火焰滅菌

  使用煤氣燃燒器、酒精燈或電燃燒器，通過火焰加熱，灰化并分解設備表面的有機物。這種滅菌方法對無菌操作期間可能粘附在手、物體或接觸空氣的區(qū)域上的微生物進行滅菌，對用于操縱細菌的鉑環(huán)和鉑絲尖端進行滅菌，并使用不含 RNase 的抹刀和鑷子。它用于諸如建立國家等目的。它主要用于金屬消毒，但也可用于玻璃和聚四氟乙烯。

  火焰頂部溫度高（氧化焰），底部溫度低（還原焰），所以進行火焰滅菌時，采用頂部氧化焰。

  請注意，如果在消毒酒精蒸發(fā)之前噴灑消毒酒精并進行火焰消毒，可能會引起火災。另外，小心不要因接觸火焰滅菌區(qū)域而被燒傷，或將熱移液管插入細胞懸浮液而損壞細胞。

  過濾除菌（過濾除菌）

  過濾滅菌適用于少量液體、不耐熱溶液、生物聚合物和有機溶劑的滅菌。

  過濾材料包括尼龍、PVDF、PES和醋酸纖維素，根據用途和樣品根據親水性和有機物吸附性能進行選擇。0.4至0.8μm的孔徑足以去除不溶性物質，但如果要去除微生物，請使用0.22μm或更小的孔徑。另外，去除支原體時，需要使用孔徑為0.1μm的過濾器。

  過濾滅菌在超凈工作臺上進行。使用注射器型時，首先將樣品吸入注射器中。此時，也吸入少量空氣。打開裝有過濾器的夾套，將注射器插入過濾器，利用活塞推出液體，過濾樣品。將濾液轉移至無菌容器中。當所有液體被推出時，空氣留在末端，但當空氣接觸到過濾器時，它會鎖定并且無法進一步被推入。如果您可以進一步推動，則表明過濾器存在泄漏，因此請嘗試使用新過濾器再次過濾。

  上面我們已經解釋了四種滅菌操作。如果程序不正確或不小心，滅菌操作可能會導致污染和事故。當你反復做、習慣了之后，特別容易失敗，所以一定要記住初衷，認真做。