科研實驗必備知識：一抗與二抗的區(qū)別

  一抗和二抗有什么區(qū)別？這是實驗室新手經(jīng)常問的問題。這里我們將從結(jié)合能力、用途與標記、來源、克隆性、預(yù)吸附五個角度來回答這個問題。

  結(jié)合能力

  抗體 (Ab) 廣泛用于研究。根據(jù)其結(jié)合能力，抗體可分為兩類：一抗和二抗。具體來說，一抗是與蛋白質(zhì)或抗原 (Ag) 或您研究的任何物質(zhì)結(jié)合的抗體，而二抗是與一抗結(jié)合的抗體?？聪聢D1：

  圖 1 主要抗體 VS二抗體

  如果您讀過我們之前的文章什么是抗體？您將對抗體結(jié)構(gòu)的良好了解，然后您會發(fā)現(xiàn)更容易理解一抗的 Fab 結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合并將其 Fc 結(jié)構(gòu)域暴露給二抗，從而二抗的 Fab 結(jié)構(gòu)域與一抗結(jié)合抗體的 Fc 結(jié)構(gòu)域。

  由于給定物種中同類的所有抗體分子的 Fc 結(jié)構(gòu)域都是相同的，因此一種類型的二抗能夠與多種類型的一抗結(jié)合。例如，當在小鼠中產(chǎn)生的IgG類抗體用作一抗時，可以使用靶向小鼠IgG Fc結(jié)構(gòu)域且不在小鼠中產(chǎn)生的抗體作為二抗。

  用途

  在免疫測定中，總是需要一抗來與靶抗原結(jié)合，但不一定使用二抗。我們以直接ELISA和間接ELISA為例。直接ELISA涉及直接標記，即一抗直接用酶標記進行酶促反應(yīng)和信號檢測，不需要二抗。間接ELISA不直接標記一抗，而是用酶標記二抗，如下圖2所示。

  圖 2 直接 ELISA 對比間接ELISA

  是否標記一抗（直接標記）或二抗（間接標記）取決于您的實驗。無論是直接標記還是間接標記都有其優(yōu)點和缺點。直接標記通常與簡單的方案相關(guān)，可以節(jié)省時間和試劑，沒有與二抗發(fā)生交叉反應(yīng)的風險，但缺乏信號放大和靈活性，并可能導致高背景。間接標記涉及信號放大，由于同一二抗可以與多種一抗反應(yīng)，因此非常靈活，但具有相對復雜的方案和交叉反應(yīng)風險。

  來源

  抗體的來源是需要考慮的一個重要方面。一抗的宿主物種應(yīng)與樣品的物種不同，以避免二抗與樣品免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。此外，二抗的宿主物種應(yīng)與一抗的宿主物種不同，因為二抗應(yīng)針對一抗的物種。

  例如，如果您研究小鼠樣本，您將需要在小鼠以外的動物中產(chǎn)生的一抗，例如在兔子中產(chǎn)生的一抗。然后，如果您使用針對小鼠的兔抗體作為一抗，您將需要在兔以外的動物中產(chǎn)生的二抗，例如在山羊中產(chǎn)生的二抗。

  為了能夠檢測目標抗原，二抗不僅應(yīng)當對一抗的種類具有特異性，而且還應(yīng)當對一抗的同種型具有特異性。例如，如果一抗是在兔體內(nèi)產(chǎn)生的 IgG1 抗體，您將需要可以與兔 IgG1 抗體反應(yīng)且不是在兔體內(nèi)產(chǎn)生的二抗。

  克隆性

  一抗可以是單克隆抗體 (mAb) 或多克隆抗體 (pAb)。

  我們首先比較一下單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體僅識別抗原上的一個表位，而多克隆抗體識別抗原上的多個表位。因此，單克隆抗體和多克隆抗體具有不同的性質(zhì)和用途。單克隆抗體具有高特異性和高重現(xiàn)性，與多克隆抗體相比，染色背景更少。然而，由于其高特異性，當抗原的化學處理改變目標表位時，單克隆抗體可能無法發(fā)揮作用。相比之下，多克隆抗體具有高親和力，能夠耐受抗原的微小變化，并且可以進行更穩(wěn)健的檢測。但多克隆抗體具有較高的批次間變異性，并且更有可能通過染色產(chǎn)生高背景。

  如果您的實驗需要高特異性，使用單克隆抗體作為一抗可能是一個不錯的選擇。如果陽性信號較弱，請嘗試多克隆抗體。由于多克隆抗體可識別多個表位，因此它們更有可能在免疫沉淀 (IP) 和染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 中提供更好的結(jié)果。但如果你想探測抗原的特定域，多克隆抗體就沒有用了，單克隆抗體作為一抗可能會更好。

  二抗可以是與一抗或其片段結(jié)合的單克隆抗體或多克隆抗體。二抗有不同形式。首先，二抗可以針對一抗的整個分子。例如，一抗通常是 IgG 同種型。然后，您需要抗 IgG H&L（重鏈和輕鏈）抗體作為二抗，它與 IgG 一抗的重鏈和輕鏈發(fā)生反應(yīng)。此外，這種抗 IgG H&L 抗體還會與一抗物種的其他免疫球蛋白類別（例如 IgM 和 IgA）發(fā)生反應(yīng)，因為給定物種中的所有免疫球蛋白都具有相同的輕鏈。其次，二抗可以對一抗的 Fab 區(qū)具有特異性。同樣，這種形式的二抗也與重鏈和輕鏈反應(yīng)，因此與具有相同輕鏈的其他免疫球蛋白類別反應(yīng)。第三，二抗可以對一抗的 Fc 區(qū)具有特異性，這意味著它僅與重鏈反應(yīng)。因此，該二抗僅與一類免疫球蛋白發(fā)生反應(yīng)，例如 IgG 或 IgM。最后，二抗可以對一抗的輕鏈具有特異性，因此它將與具有相同輕鏈的所有免疫球蛋白類別發(fā)生反應(yīng)。關(guān)于單克隆和多克隆，可以參考這篇文章《蛋白質(zhì)免疫測定：認識多克隆抗體和單克隆抗體》

  5、預(yù)吸附

  二抗有時需要額外的純化過程，稱為預(yù)吸附，以提高特異性并最大限度地減少非特異性。在預(yù)吸附過程中，含有二抗的溶液通過含有來自潛在交叉反應(yīng)物種（例如樣品物種）的固定血清蛋白或免疫球蛋白的柱基質(zhì)。通過這個過程，溶液中的非特異性抗體將被去除，而高度特異性的二抗被留下。例如，如果您使用小鼠組織，請選擇已吸附小鼠血清或小鼠 IgG 的二抗。

  預(yù)吸附的二抗產(chǎn)生較少的非特異性結(jié)合，因此不太可能產(chǎn)生非特異性背景。當您在多重標記實驗中測定蛋白質(zhì)表達或研究富含免疫球蛋白的組織或細胞時，建議您使用預(yù)吸附二抗。

  綜上所述，一抗和二抗之間存在一些差異。首先，一抗和二抗具有不同的結(jié)合能力。一抗與檢測到的抗原結(jié)合，而二抗與一抗（通常是其 Fc 結(jié)構(gòu)域）結(jié)合。其次，免疫分析中總是需要一抗，而二抗則不一定需要，這取決于實驗方法（直接或間接標記）。第三，產(chǎn)生的一抗的物種與樣品不是同一物種，產(chǎn)生的二抗的物種與一抗的物種來源不同。第四，一抗和二抗都可以是單克隆或多克隆，但克隆性的選擇需要考慮不同的因素。最后，二抗有時需要預(yù)吸附，而一抗一般不需要。

  現(xiàn)在，您可能會更好地了解一抗和二抗之間的差異，并會發(fā)現(xiàn)更容易為您的實驗選擇正確的抗體。選擇正確的抗體從來都不是一件容易的事。如果您選擇的抗體不適合您的實驗，您可能會浪費金錢、時間和寶貴的樣品。如果您對一抗和二抗還有疑問，歡迎前來咨詢。