什么是實時 PCR (qPCR)？一文了解工作原理

  核酸擴增和檢測技術是當今生物研究中最有價值的工具之一。生命科學各個領域（基礎研究、生物技術、醫(yī)學、法醫(yī)學、診斷學等）的科學家在廣泛的應用中利用這些方法。對于某些應用，定性核酸檢測就足夠了。然而，其他應用則需要定量分析。實時熒光定量PCR可用于定性和定量分析；為您的應用選擇最佳方法需要對該技術有廣泛的了解。上海通蔚蔚您介紹實時 PCR、反轉(zhuǎn)錄定量 PCR 技術以及 Bio-Rad 為這些技術提供的儀器選擇。它還提供了 RNA 分離步驟的提示，例如樣品收集、RNA 提取以及分析 RNA 的質(zhì)量和數(shù)量。

  頁面內(nèi)容

  什么是實時 PCR？

  實時 PCR/qPCR 檢測的應用

  實時熒光定量 PCR 是如何工作的？

  RNA分離

  逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR (RT-qPCR)

  qPCR/實時 PCR 儀器

  什么是實時 PCR？

  在傳統(tǒng) PCR 中，擴增的 DNA 產(chǎn)物或擴增子在終點分析中進行檢測。在實時 PCR 中，隨著反應的進行，實時測量擴增產(chǎn)物的積累，并在每個循環(huán)后進行產(chǎn)物定量。

  下面的 qPCR 工作流程描述了實時 PCR 的步驟。首先，使用 PCR 試劑和獨特或定制引物設置擴增反應。然后在實時 PCR 儀器中運行反應，并通過專有儀器軟件分析收集的數(shù)據(jù)。

  PCR 產(chǎn)物的實時檢測是通過在每個反應孔中包含熒光報告分子來實現(xiàn)的，隨著產(chǎn)物 DNA 量的增加，熒光報告分子會產(chǎn)生增強的熒光。用于此目的的熒光化學包括DNA結合染料和熒光標記的序列特異性引物或探針。配備熒光檢測模塊的專用熱循環(huán)儀用于在擴增發(fā)生時監(jiān)測熒光信號。測得的熒光與擴增子總量成正比；熒光隨時間的變化用于計算每個循環(huán)中產(chǎn)生的擴增子的量。

  與 PCR 相比，實時 PCR 的主要優(yōu)點是，實時 PCR 允許您在寬動態(tài)范圍內(nèi)準確且高靈敏度地確定模板 DNA（擴增目標序列）的初始拷貝數(shù)。實時 PCR 結果可以是定性的（序列是否存在）或定量的（拷貝數(shù)）。因此，定量實時 PCR 也稱為 qPCR 分析。相比之下，PCR 至多是半定量的。此外，無需凝膠電泳即可評估實時 qPCR 數(shù)據(jù)，從而減少實驗時間并提高通量。最后，由于在統(tǒng)一的閉管 qPCR 系統(tǒng)中運行實時 qPCR 反應并評估數(shù)據(jù)，因此減少了污染的機會，并且在 qPCR 分析中消除了擴增后操作的需要。

  實時 PCR/qPCR 檢測的應用

  實時 PCR/qPCR 檢測已成為快速、靈敏地測定和定量各種生物樣品中核酸的首選工具，具有多種應用，例如基因表達分析、食品中轉(zhuǎn)基因生物的檢測和癌癥表型分析。

  在研究實驗室中，qPCR 檢測廣泛用于定量測量轉(zhuǎn)化細胞系中的基因拷貝數(shù)（基因劑量）或突變基因的存在。與逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR) 相結合，qPCR 檢測可通過測量細胞中的變化來精確定量基因表達的變化，例如，響應不同環(huán)境條件或藥物治療的表達增加或減少。 mRNA 水平。

  實時熒光定量 PCR 是如何工作的？

  為了了解實時 PCR 的工作原理，我們使用典型的擴增圖來說明 qPCR 分析（圖 1）。在此圖中，x 軸顯示 PCR 循環(huán)數(shù)，y 軸顯示擴增反應的熒光（與管中擴增產(chǎn)物的量成正比）。

  擴增圖顯示兩個階段，指數(shù)階段，隨后是非指數(shù)平臺階段。在指數(shù)生長期，PCR 產(chǎn)物的量在每個循環(huán)中大約翻倍。然而，隨著反應的進行，反應組分被消耗，并且最終一種或多種組分變得有限。此時，反應減慢并進入平臺期（圖 1 中的循環(huán) 28-40）。

  最初，熒光保持在背景水平，并且即使產(chǎn)物呈指數(shù)累積，也無法檢測到熒光的增加（循環(huán) 1-18，圖 1）。最終，積累足夠的擴增產(chǎn)物以產(chǎn)生可檢測的熒光信號。發(fā)生這種情況的循環(huán)數(shù)稱為定量循環(huán)或 C q。由于 C q值是在試劑不受限制的指數(shù)期測量的，因此實時 qPCR 可用于基于描述反應進程的已知指數(shù)函數(shù)可靠且準確地計算反應中存在的模板的初始量。

  反應的C q主要由擴增反應開始時存在的模板量決定。如果反應開始時存在大量模板，則需要相對較少的擴增循環(huán)來積累足夠的產(chǎn)物以產(chǎn)生高于背景的熒光信號。因此，反應的 C q較低或較早。相反，如果反應開始時存在少量模板，則需要更多的擴增循環(huán)才能使熒光信號升至背景之上。因此，反應將具有高或晚的 C q。這種關系構成了實時 PCR 定量方面的基礎。

  RNA分離

  樣品采集

  對于RNA 分離 和基因表達定量，樣品材料應盡可能均勻。如果您的組織樣本由許多不同的細胞類型組成，那么精確定位靶基因的表達模式可能會很困難。如果您有異質(zhì)樣品，請使用可用于分離和分離特定細胞類型的多種方法之一，例如組織解剖、針活檢和激光捕獲顯微切割。然后可以使用收集的細胞來獲取 RNA 樣本。

  RNA 提取

  總 RNA 或 Poly(A+) RNA 可用于大多數(shù)實時 RT-qPCR 應用。使用 RNA 時的一項關鍵考慮因素是消除解決方案、耗材和實驗室器具中的 RNase。您可以購買即用型無 RNase 溶液，也可以用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 處理您的溶液，然后進行高壓滅菌。實驗室器具上的 RNase 也可以通過 DEPC 處理或在 250°C 下烘烤 3 小時來滅活。

  制備的 RNA 樣品可能需要 DNase 處理，以防止任何污染基因組 DNA 的潛在擴增，這可能導致高估 mRNA 的拷貝數(shù)。然而，當起始材料有限時，DNA酶處理可能是不可取的，因為額外的操作可能會導致RNA損失。通過設計轉(zhuǎn)錄特異性引物，例如跨剪接點或跨剪接點擴增的引物，可以防止?jié)撛谖廴镜幕蚪MDNA的擴增。

  分析核酸數(shù)量和質(zhì)量

  準確的核酸定量對于基因表達分析至關重要，特別是當使用總 RNA 量來標準化靶基因表達時。RNA濃度和純度通常通過測量 260 nm 和 280 nm 處的 UV 吸光度比率來確定。

  逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR (RT-qPCR)

  有兩種方法可用于通過 RT-qPCR 定量基因表達：兩步 RT-qPCR 和一步 RT-qPCR。在這兩種情況下，RNA 都會逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后將 cDNA 用作 qPCR 擴增的模板。一步和兩步是指RT和實時PCR擴增是在同一管還是分開的管中進行。在兩步法中，RNA 首先在使用逆轉(zhuǎn)錄酶的反應中轉(zhuǎn)錄成 cDNA。然后將所得 cDNA 的等分試樣用作多個 qPCR 反應的模板。在一步法中，RT 和 qPCR 在同一管中進行。

  qPCR/實時 PCR 儀器

  實時 PCR 檢測系統(tǒng)由配備光學檢測模塊的熱循環(huán)儀組成，用于測量每個擴增循環(huán)期間熒光團與目標序列結合時產(chǎn)生的熒光信號。Bio-Rad 實時 PCR 檢測系統(tǒng) 配備帶有可互換模塊的熱循環(huán)儀，用于熒光團的單重和多重檢測以及固定的實時 PCR 單元。所有 qPCR 系統(tǒng)均具有熱梯度功能。