ELISA是什么檢測(cè)方法？帶您深入了解ELISA

  ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）是實(shí)驗(yàn)室中使用的一種免疫測(cè)定方法，用于檢測(cè)和定量血清或血液樣本的復(fù)雜混合物中的可溶性物質(zhì)，例如肽、蛋白質(zhì)和抗體。該測(cè)定也稱為酶免疫測(cè)定（EIA）。
  
  在此測(cè)定中，抗原或抗體被固定在 ELISA 板的表面，分析物在板中孵育以與靶標(biāo)結(jié)合。然后通過(guò)提供特定的生理?xiàng)l件來(lái)洗脫抗原-抗體復(fù)合物。
  
  ELISA檢測(cè)的整個(gè)過(guò)程可分為三個(gè)階段：
  
  1、包被/捕獲：將特異性抗原固定在96孔板的表面。通常捕獲抗體被固定在表面上以捕獲目標(biāo)抗原。
  
  2、板封閉：為了避免背景信號(hào)并確保目標(biāo)抗原和特異性抗體之間的有效結(jié)合，板的剩余表面用一些蛋白質(zhì)覆蓋。
  
  3、探測(cè)/檢測(cè)：將含有反應(yīng)混合物的 ELISA 板與與目標(biāo)抗原結(jié)合的抗原特異性抗體一起孵育。酶聯(lián)檢測(cè)抗體用于產(chǎn)生顯示測(cè)試樣品中存在的抗原/分析物量的信號(hào)。
  
  ELISA測(cè)定中使用的檢測(cè)抗體是傳統(tǒng)的單克隆抗體、多克隆抗體或重組單克隆抗體。此外，在測(cè)定過(guò)程中要確保的一件事是捕獲抗體和檢測(cè)抗體都必須識(shí)別不重疊的表位。
  
  ELISA 方案中經(jīng)常涉及的酶綴合物包括 β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶 (AP)、辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 和過(guò)氧化氫酶。它們與特定的底物結(jié)合以產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)范圍。
  
  4、信號(hào)測(cè)量：使用讀板機(jī)讀取目標(biāo)抗原和抗體之間反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)量。獲得的數(shù)據(jù)可以是定量的、半定量的和定性的。在定量研究中，濃度結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，該曲線將光密度與對(duì)數(shù)濃度進(jìn)行比較。
  
  在本文中，上海通蔚生物將介紹四種常見(jiàn)類型的 ELISA 方法以及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室中用于一系列研究應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)。
  

  ELISA 有哪些類型？

  
  ELISA檢測(cè)主要有四種類型：
  
  1. 直接 ELISA
  
  直接 ELISA 技術(shù)涉及將抗原固定在聚苯乙烯微孔板上，然后使用蛋白質(zhì)（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA 或任何其他動(dòng)物蛋白）封閉微孔板。然后，洗滌板并與一抗一起孵育。
  

  在此測(cè)定中，一抗直接與底物（例如 HRP 或 AP）結(jié)合，導(dǎo)致顏色變化。由于過(guò)程中只涉及較少的步驟，直接 ELISA 是一種適用于實(shí)驗(yàn)室工作流程的快速技術(shù)，同時(shí)還消除了二抗交叉反應(yīng)。但其缺點(diǎn)是反應(yīng)靈敏度低、成本低。

  
  
  2. 間接 ELISA
  
  該技術(shù)的步驟與直接 ELISA 類似。唯一的區(qū)別是涉及額外的洗滌步驟以及該過(guò)程中使用的抗體類型。
  
  間接 ELISA工作流程中  涉及兩種類型的抗體：一抗和二抗。
  
  首先添加一抗并洗滌，然后與標(biāo)記的二抗一起孵育。
  

  間接 ELISA 的優(yōu)點(diǎn)是成本較低、更加靈敏和靈活。然而，由于二抗的存在，檢測(cè)過(guò)程中存在交叉反應(yīng)的可能性。

圖：間接 ELISA 涉及的步驟

  
  3. 三明治 ELISA
  
  在此測(cè)定中，抗原夾在兩種抗體之間。這就是該測(cè)定被稱為夾心 ELISA 的原因。該測(cè)定首先使用捕獲抗體包被微孔板表面，用 BSA 封閉表面，然后向微孔板中添加抗原，持續(xù)約 90 分鐘。
  
  孵育步驟后，用緩沖液清洗板，然后與標(biāo)記的二抗一起孵育。然后，添加底物來(lái)研究和測(cè)量反應(yīng)信號(hào)。
  

  盡管夾心 ELISA 具有最高的靈敏度，但其主要缺點(diǎn)是該過(guò)程所需的時(shí)間和費(fèi)用。此外，尋找完美抗原抗體對(duì)的必要性也是該測(cè)定的限制。

  
  4. 競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA
  
  該測(cè)定檢測(cè)測(cè)試樣品中抗原特異性抗體的存在。它涉及使用兩種抗體：樣品中存在的抗體和酶聯(lián)抗體。它們?cè)诜磻?yīng)過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)抗原。沒(méi)有顏色代表陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果，而有顏色則代表陰性測(cè)試結(jié)果。
  

  該測(cè)定法不能用于經(jīng)過(guò)任何程度稀釋的樣品，并且靈敏度較低。然而，它有許多優(yōu)點(diǎn)，例如需要較少的樣品純化、較小的變異性以及分析樣品中的一系列抗原。

圖：競(jìng)爭(zhēng) ELISA 涉及的步驟說(shuō)明

  

  常用的ELISA檢測(cè)方法有哪些？

  
  在 ELISA 中，經(jīng)常使用與特定抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體。因此，當(dāng)將能夠轉(zhuǎn)化酶的底物添加到反應(yīng)混合物中時(shí)，會(huì)引起溶液顏色的變化。使用檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)或分析信號(hào)。
  
  根據(jù)酶和底物的不同，ELISA 檢測(cè)中的檢測(cè)方法差異很大。如今，還有許多 ELISA 試劑盒可讓您輕松進(jìn)行 ELISA 測(cè)定。但是，它不包含執(zhí)行檢測(cè)所需的通用試劑，例如 tween-20、磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)、封閉緩沖液、洗滌緩沖液等。
  
  目前有許多檢測(cè)方法可用于研究抗原抗體復(fù)合物之間的反應(yīng)，例如比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法和顯色法。然而，下面介紹了其中最常見(jiàn)的三種。
  
  1、化學(xué)發(fā)光分析
  
  該技術(shù)利用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的檢測(cè)抗體，例如 HRP 和 AP?；隰斆字Z的溶液用作形成反應(yīng)產(chǎn)物的底物，發(fā)射光子，可以使用光度計(jì)讀取光子。
  
  與其他檢測(cè)方法相比，該技術(shù)具有超靈敏性，具有更寬的動(dòng)態(tài)范圍，甚至可以檢測(cè)給定樣品中最少量的分析物。
  
  2、顯色測(cè)定
  
  顯色法是ELISA檢測(cè)方法中最常見(jiàn)的類型之一。它涉及使用辣根過(guò)氧化物酶 (HRP-) 或堿性磷酸酶 (AP-) 標(biāo)記的抗體與顯色底物（例如四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 溶液）結(jié)合使用。
  
  該技術(shù)利用反應(yīng)的吸光度來(lái)確定讀數(shù)，用于比較樣品或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)感興趣分子的濃度。
  
  3、熒光分析
  
  該技術(shù)將過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的檢測(cè)抗體（例如 HRP 和 AP）與暴露于某些光波長(zhǎng)時(shí)發(fā)出熒光的熒光底物相結(jié)合。即使分析物濃度較高，信號(hào)也不會(huì)飽和，并提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。
  
  總的來(lái)說(shuō)，Elisa是一種靈敏、特異、快速的檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品安全等領(lǐng)域。盡管Elisa具有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些限制，例如對(duì)于某些特定的檢測(cè)目標(biāo)，可能存在交叉反應(yīng)或假陽(yáng)性結(jié)果。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)具體需求和目標(biāo)選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，并對(duì)其進(jìn)行合理評(píng)估和優(yōu)化。隨著科技的不斷發(fā)展，Elisa技術(shù)也將不斷完善和進(jìn)步，為人類的生活和科學(xué)研究提供更多幫助。