elisa實驗：認識比色測定、發(fā)光和熒光的方法

  ELISA最初是為了取代放射免疫測定(RIA)中常用的放射性碘標簽而開發(fā)的。它們通常包含96孔板形式，孔上結(jié)合有抗原（直接和間接ELISA）或抗體（夾心和競爭性ELISA）。通過一系列封閉清洗和檢測步驟，測量待測生物樣品中分析物的濃度，通常與已知抗原濃度的系列或標準稀釋曲線進行比較。關(guān)于elisa方法，可以參考：《ELISA是什么檢測方法？帶您深入了解ELISA》

  ELISA中常用三種不同的檢測系統(tǒng)：比色測定、發(fā)光和熒光。這些都依賴于一種顯示反應(yīng)介質(zhì)中可量化變化的方法，通常是顯色，這取決于分析物的濃度。在ELISA過程結(jié)束時，添加與酶聯(lián)報告基因發(fā)生反應(yīng)的酶底物試劑，從而發(fā)生顏色變化。

  與抗體結(jié)合的最常見報告基因是辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)和β-D-半乳糖苷酶(BG)。這三種物質(zhì)在標準測定條件下都很穩(wěn)定、呈惰性，并且相對易于使用。

  HRP是一種小分子，因此，當它與測定抗體結(jié)合時，不會引起空間位阻并干擾抗原結(jié)合。然而，它會受到某些常見防腐劑（例如疊氮化鈉）的影響，并且還可能受到生物樣品中內(nèi)源過氧化物酶活性的影響。確保ELISA期間進行充分的洗滌步驟通?？梢詼p輕干擾。

  AP是較大的分子，因此必須注意避免空間位阻。檢測還需要更嚴格的條件，因此應(yīng)使用AP特異性檢測緩沖液。

  BG是一種更大的分子，但更適合疏水性膜表面（例如斑點印跡），因為用作潤濕劑的酒精可以增強檢測。

  ELISA檢測方法

  ELISA測定通過測量報告分子對作為測定最后步驟添加的酶底物的作用來讀取。底物的選擇取決于測定形式。例如，不溶性的最終結(jié)果最適合膜結(jié)合反應(yīng)，例如斑點印跡。

  其他考慮因素包括預(yù)期濃度范圍、測定時間、靈敏度和使用的檢測裝置。例如，在預(yù)期濃度范圍較廣的情況下，使用反應(yīng)超過15至30分鐘的酶底物可能會產(chǎn)生最佳結(jié)果。分析物濃度極低的靈敏測定需要快速作用的底物。具有定時終點的測定包括在讀數(shù)之前停止并穩(wěn)定反應(yīng)的終止步驟。還可以通過在一段時間內(nèi)進行多次測量來監(jiān)控轉(zhuǎn)化率，以顯示動力學(xué)分析。

  比色測定檢測顯示可以在可見光譜中定量的顏色變化，其中光密度隨濃度變化。在讀取平板之前，持續(xù)孵育以使所有孔均等發(fā)育非常重要。

  熒光免疫測定使用在某些光波長激發(fā)時發(fā)出熒光的酶底物。它們通常與比色測定一樣靈敏，但不受較高分析物濃度的限制。它們可以發(fā)出更強烈的光，而不會產(chǎn)生壓倒性的信號檢測，從而提供準確的讀數(shù)。

  ELISA中的發(fā)光檢測依賴于生物發(fā)光（其中光由生物底物產(chǎn)生）或化學(xué)發(fā)光（其中化學(xué)反應(yīng)后釋放光子）。由于發(fā)光技術(shù)與信號倍增和放大的兼容性，因此被認為是ELISA檢測最靈敏的方法。

  上述內(nèi)容為大家介紹ELISA檢測方法，大家可以根據(jù)自身的實驗來對照自己需要的檢測方法，從而提高實驗結(jié)果的讀數(shù)。