PCR、RT-PCR 和 qPCR：哪種技術(shù)是你的科研助手？

  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種相對簡單且廣泛使用的分子生物學(xué)技術(shù)，用于擴(kuò)增和檢測DNA和RNA序列。與傳統(tǒng)的DNA克隆和擴(kuò)增方法相比，PCR只需要數(shù)小時，具有快速、高效和特異性強(qiáng)。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)需求，目前在PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)。大家在實(shí)驗(yàn)中還接觸到了RT-PCR和qPCR。今天，上海通蔚給大家來介紹一下它們之間的區(qū)別。

  PCR

  聚合酶鏈反應(yīng)，也就是PCR（polymerasechainreaction）技術(shù)，這是一種使用DNA聚合酶拷貝選定DNA區(qū)域的技術(shù)，由KaryMullis及同事在20世紀(jì)80年代發(fā)明，KaryMullis也因此被授予了諾貝爾化學(xué)獎。PCR常用于基因克隆、基因分析、基因診斷、DNA指紋識別等領(lǐng)域。

  PCR實(shí)驗(yàn)前需要 DNA聚合酶、鎂、核苷酸、引物、待擴(kuò)增的DNA模板和熱循環(huán)儀。PCR由三個步驟組成：變性-退火-延伸。

  模版DNA變性：雙鏈DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使其解離使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

  模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)；

  引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。經(jīng)過一系列溫度和時間的變性、退火和延伸過程稱為一個擴(kuò)增循環(huán)。循環(huán)的每個步驟都應(yīng)針對所使用的模板和引物組進(jìn)行優(yōu)化。該循環(huán)重復(fù)大約20-40次，然后通常通過瓊脂糖凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 PCR擴(kuò)增示意圖

  RT-PCR

  逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription PCR）或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR,RT-PCR），是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的一種廣泛應(yīng)用的變形。RT-PCR靈敏度高，操作簡單，常用于基因表達(dá)分析、病毒檢測、RNA 病毒的定量等領(lǐng)域等。

  RT-PCR和PCR區(qū)別在于它是從mRNA模版開始，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性引物的引導(dǎo)下合成互補(bǔ)的DNA(complementaryDNA，cDNA)，按照普通PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板，則可擴(kuò)增出不含內(nèi)含子的可編碼完整基因的序列。

圖2 逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR原理圖

  qPCR

  qPCR實(shí)時定量PCR（real-timePCR）是是一種在DNA擴(kuò)增時（即實(shí)時）對其定量的方法，常用于基因表達(dá)定量、病原體檢測、基因分型。與普通PCR一樣，DNA通過三個重復(fù)步驟進(jìn)行擴(kuò)增：變性、退火和延伸。在qPCR中，熒光標(biāo)記可以隨著PCR的進(jìn)展收集數(shù)據(jù)。由于可用的方法和化學(xué)物質(zhì)范圍廣泛，該技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)。在基于染料的qPCR（通常為綠色）中，熒光標(biāo)記允許通過使用dsDNA結(jié)合染料對擴(kuò)增的DNA分子進(jìn)行定量。在每個循環(huán)期間，測量熒光。熒光信號隨復(fù)制DNA的數(shù)量成比例增加。

圖3 qPCR實(shí)時定量原理圖

  上述為大家介紹了PCR、RT-PCR和qPCR區(qū)別，選擇哪種技術(shù)取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托枨蟆?/span> 如果只需要確定是否存在特定 DNA 或 RNA 序列，可以選擇 PCR 或 RT-PCR；如果需要精確量化起始模板的含量，則 qPCR 是更好的選擇。關(guān)于PCR還有疑問，歡迎前來咨詢。上海通蔚有上述三種技術(shù)的PCR試劑盒，對PCR試劑盒有需要的歡迎前來咨詢，我們PCR試劑盒快速、高效、特異性強(qiáng)。