ELISA是用來(lái)檢測(cè)什么的？ELISA檢測(cè)原理及實(shí)踐應(yīng)用指南

  在生命科學(xué)領(lǐng)域的許多情況下，及時(shí)且經(jīng)濟(jì)高效地檢測(cè)和定量樣品中的抗原或抗體非常重要。從識(shí)別接種疫苗或感染個(gè)

體的免疫反應(yīng)，檢測(cè)您希望在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá)，到執(zhí)行質(zhì)量控制測(cè)試。擁有能夠進(jìn)行此類評(píng)估的工具是關(guān)鍵。

通蔚elisa試劑盒

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)就是這樣一種測(cè)試，已被證明作為研究和診斷工具具有無(wú)價(jià)的價(jià)值。作為科研人員，了解認(rèn)識(shí)ELISA檢測(cè)方法，不僅有助于他們更好地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，更能為他們的科研成果提供有力支撐。

  ELISA檢測(cè)原理

  ELISA基于抗原抗體反應(yīng)的概念，代表白細(xì)胞B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體與抗原之間的化學(xué)相互作用。這種特定的免疫反應(yīng)在保護(hù)身體免受病原體和毒素等入侵者的侵害方面發(fā)揮著重要作用。因此，通過(guò)利用這種反應(yīng)，ELISA可以對(duì)抗原進(jìn)行高度靈敏和選擇性的定量/定性分析，包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、激素、除草劑和植物次生代謝物。為了檢測(cè)這些分子，使用酶標(biāo)記抗原或抗體，即所謂的酶免疫測(cè)定，其中堿性磷酸酶（ALP）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和β-半乳糖苷酶都常用。液相中的抗原被固定在固相上，例如由硬質(zhì)聚苯乙烯、聚氯乙烯和聚丙烯構(gòu)成的微量滴定板。隨后，使抗原與特異性抗體反應(yīng)，并通過(guò)酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。使用顯色底物產(chǎn)生的顏色對(duì)應(yīng)于抗原的存在。例如，ALP水解磷酸對(duì)硝基苯酯產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，可在405 nm（黃色）處檢測(cè)到，而HRP催化顯色底物的轉(zhuǎn)化，例如2,2'-連氮基-雙（3-乙基苯并噻唑啉）-6-磺酸）二銨鹽、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺、鄰苯二胺生成有色產(chǎn)品。通過(guò)使用化學(xué)發(fā)光底物（例如分別用于ALP和HRP的氯-5-取代金剛烷基-1,2-二氧雜環(huán)丁烷磷酸鹽和魯米諾）以及用于β-半乳糖苷酶的熒光底物（例如4-甲基傘形基半乳糖苷和硝基苯基半乳糖苷），可以實(shí)現(xiàn)更靈敏的檢測(cè)取得成就。這些酶-底物反應(yīng)通常在30-60分鐘內(nèi)完成，對(duì)于各個(gè)反應(yīng)，通過(guò)添加適當(dāng)?shù)娜芤海ɡ鐨溲趸c、鹽酸、硫酸、碳酸鈉和疊氮化鈉）來(lái)停止反應(yīng)。最后，使用微量滴定板讀數(shù)器檢測(cè)有色或熒光產(chǎn)物。

  ELISA檢測(cè)步驟

  ELISA有多種常用方法類型。但它們都利用在96孔聚苯乙烯板底部堆積的抗體和抗原。這些孔經(jīng)過(guò)化學(xué)處理，使其具有“粘性”，從而增加了蛋白質(zhì)吸附到板表面的能力。

  ELISA測(cè)定依賴于酶結(jié)合標(biāo)記和底物之間的酶促反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生比色、化學(xué)發(fā)光或熒光產(chǎn)物。然后通過(guò)分光光度計(jì)或熒光計(jì)檢測(cè)和定量這些產(chǎn)物，提供有關(guān)樣品中目標(biāo)蛋白濃度的信息。

  ELISA由多個(gè)步驟組成。其中許多步驟是封閉和洗滌步驟，以防止非特異性結(jié)合。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)通過(guò)脫靶相互作用相互吸附或吸附到ELISA板的塑料表面時(shí)，就會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合。不同方法之間的確切ELISA步驟略有不同，但這里我們將重點(diǎn)關(guān)注夾心ELISA作為示例。

  夾心ELISA步驟

  第1步：捕獲蛋白的固定化

  在夾心ELISA中，捕獲蛋白是抗體，目標(biāo)是抗原。因此，ELISA的第一個(gè)步驟是將捕獲抗體固定到板上。許多ELISA試劑盒都帶有預(yù)先固定的捕獲蛋白。

  第2步：洗掉孔表面任何未吸附的捕獲蛋白

  使用去污劑的洗滌步驟可減少蛋白質(zhì)之間的脫靶疏水相互作用，并從板上去除未結(jié)合的捕獲蛋白質(zhì)。

  第3步：封閉板上任何未結(jié)合的位點(diǎn)

  蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用是由電荷或疏水性介導(dǎo)的。這意味著可以通過(guò)封閉和清洗步驟在一定程度上減輕它們。

  將蛋白質(zhì)添加到板中，蛋白質(zhì)吸附到板表面的開(kāi)放位點(diǎn)。牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或抑肽酶等蛋白質(zhì)通常用于ELISA測(cè)定中的封閉。

  這些蛋白質(zhì)將吸附到板上，從而防止目標(biāo)蛋白質(zhì)隨后訪問(wèn)這些位點(diǎn)。以這種方式降低非特異性結(jié)合的發(fā)生率會(huì)導(dǎo)致背景噪音降低。

  第4步：洗掉孔中所有未吸附的封閉蛋白

  第二個(gè)洗滌步驟去除任何未結(jié)合的封閉蛋白。

  第5步：與樣品（血清、尿液、唾液或加標(biāo)研究溶液）一起孵育

  在這一步中，抗體和抗原之間發(fā)生特異性識(shí)別。在夾心ELISA中，抗體被吸附到板上，并與樣品液中的目標(biāo)抗原結(jié)合。這需要一個(gè)孵育步驟以使結(jié)合動(dòng)力學(xué)達(dá)到平衡。

  第6步：洗掉孵化液

  這是至關(guān)重要的洗滌步驟，通常需要多次洗滌以確保洗掉任何未結(jié)合的抗原。在此步驟之后，孔中唯一應(yīng)保留的抗原是那些附著于捕獲抗體的抗原。

  第7步：與檢測(cè)抗體一起孵育

  ELISA中的檢測(cè)抗體與某種標(biāo)記物結(jié)合，例如熒光團(tuán)（用于熒光測(cè)定）或酶（用于比色檢測(cè)或化學(xué)發(fā)光）。檢測(cè)抗體“識(shí)別”目標(biāo)抗原上與捕獲抗體不同的表位。因此，三明治ELISA測(cè)定產(chǎn)生捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體的“三明治”。

  第8步：洗掉未結(jié)合的檢測(cè)抗體

  步驟9：應(yīng)用底物進(jìn)行化學(xué)比色或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，或應(yīng)用入射光進(jìn)行熒光反應(yīng)，并對(duì)信號(hào)進(jìn)行定量

  根據(jù)所使用的ELISA方法，熒光量、發(fā)光量或顏色強(qiáng)度表明從樣品中捕獲了多少目標(biāo)抗原。

  ELISA與其他檢測(cè)方法的區(qū)別

在生命科學(xué)領(lǐng)域，科研人員經(jīng)常需要運(yùn)用各種檢測(cè)方法對(duì)生物樣本進(jìn)行定性和定量分析。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）作為其中的一種常用技術(shù)，與其他檢測(cè)方法相比，既存在相似之處，也有其獨(dú)特之處。為了更直觀的表達(dá)，下面就以表格對(duì)比：

	ELISA	其他免疫學(xué)檢測(cè)方法（如免疫熒光、免疫組化）	PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）	免疫印跡
原理	抗原-抗體特異性結(jié)合，酶促反應(yīng)放大信號(hào)	抗原-抗體特異性結(jié)合	DNA復(fù)制擴(kuò)增特定序列	蛋白質(zhì)與抗體的特異性結(jié)合
操作流程	簡(jiǎn)便、快速，高通量	相對(duì)簡(jiǎn)便，但可能涉及熒光標(biāo)記等步驟	復(fù)雜，需要精密的儀器和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件	相對(duì)復(fù)雜，涉及電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟
檢測(cè)范圍	抗原、抗體檢測(cè)，廣泛適用于多個(gè)領(lǐng)域	抗原、抗體檢測(cè)，多用于組織或細(xì)胞定位	DNA、RNA特定序列檢測(cè)	蛋白質(zhì)表達(dá)分析
靈敏度和特異性	高靈敏度和特異性	高靈敏度和特異性	極高靈敏度和特異性	高靈敏度和特異性
樣本要求	對(duì)樣本純度要求較高	對(duì)樣本純度有一定要求	對(duì)DNA/RNA質(zhì)量要求較高	對(duì)蛋白質(zhì)樣本質(zhì)量有一定要求
結(jié)果解讀	需要謹(jǐn)慎，避免干擾因素影響	需要根據(jù)熒光信號(hào)等判斷	需要通過(guò)凝膠電泳和序列分析	通過(guò)條帶位置和強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)表達(dá)
適用場(chǎng)景	疾病診斷、藥物研發(fā)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等	組織學(xué)、病理學(xué)等研究	基因檢測(cè)、疾病診斷、分子生物學(xué)研究	蛋白質(zhì)表達(dá)分析、信號(hào)通路研究

  請(qǐng)注意，這個(gè)表格只是對(duì)ELISA和其他幾種常見(jiàn)檢測(cè)方法的一個(gè)簡(jiǎn)要對(duì)比，實(shí)際上每種檢測(cè)方法都有其獨(dú)特的特點(diǎn)和適用場(chǎng)景?？蒲腥藛T在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體的研究需求和實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇最合適的檢測(cè)方法。

  ELISA檢測(cè)應(yīng)用

  ELISA可用來(lái)定量一份檢測(cè)樣品中的一種或多種抗原。鑒于抗體試劑的特異性以及檢測(cè)的簡(jiǎn)易性，ELISA通常被視為生物樣品定量檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。在生物醫(yī)學(xué)/生物化學(xué)領(lǐng)域，使用抗體-抗原結(jié)合連同信號(hào)放大的ELISA原理的檢測(cè)非常普遍。在研究實(shí)驗(yàn)室，這些檢測(cè)可用來(lái)定量蛋白水平或通路激活。在臨床上，ELISA有各種用途，包括測(cè)定患者血清樣品中藥物治療的生物標(biāo)記物或細(xì)胞因子水平。ELISA還適用于植物生物學(xué)，并且可用于檢測(cè)農(nóng)作物過(guò)敏原。

  將ELISA用作一種研究工具

  在多種研究領(lǐng)域都會(huì)用到ELISA平臺(tái)。它能特異并靈敏地檢測(cè)抗體，因此是一種方便的生物發(fā)現(xiàn)工具。它在所有生物研究領(lǐng)域中被廣泛用來(lái)檢測(cè)和定量目的抗原。這類抗原會(huì)被分泌成細(xì)胞培養(yǎng)基、某種細(xì)胞中的總蛋白，或細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)期間發(fā)生的翻譯后修飾(PTM)。

  將ELISA用作一種診斷工具

  除了用于研究之外，ELISA還廣泛用于診斷檢測(cè)，包括對(duì)病毒感染、食物過(guò)敏原、毒性和癌癥的診斷檢測(cè)。用抗體檢測(cè)感染性病毒是一種快速的臨床檢測(cè)，這種檢測(cè)在擴(kuò)展后可同時(shí)檢測(cè)多份樣品。這些檢測(cè)通常在血清或血樣上完成，但也可以使用細(xì)胞或組織的裂解物進(jìn)行。

  ELISA檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)

  隨著生命科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和科研需求的日益增長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）作為一種經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)，其發(fā)展趨勢(shì)也備受關(guān)注。未來(lái)，ELISA檢測(cè)將在以下幾個(gè)方面展現(xiàn)出明顯的發(fā)展趨勢(shì)：

  一、自動(dòng)化和智能化將成為ELISA檢測(cè)的重要發(fā)展方向。傳統(tǒng)的ELISA實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程雖然相對(duì)簡(jiǎn)便，但仍存在繁瑣的樣本處理、試劑添加和結(jié)果判讀等步驟。隨著自動(dòng)化儀器和人工智能技術(shù)的不斷發(fā)展，未來(lái)的ELISA檢測(cè)將實(shí)現(xiàn)更高程度的自動(dòng)化和智能化，從樣本處理到結(jié)果分析，整個(gè)過(guò)程將更加快速、準(zhǔn)確和便捷。

  二、高靈敏度和高特異性將是ELISA檢測(cè)追求的另一個(gè)重要目標(biāo)。隨著科研人員對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制、藥物作用機(jī)制等問(wèn)題的深入研究，對(duì)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和特異性要求也越來(lái)越高。未來(lái)，通過(guò)優(yōu)化抗體選擇、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件、引入新的信號(hào)放大技術(shù)等手段，ELISA檢測(cè)的靈敏度和特異性將得到進(jìn)一步提升，為科研人員提供更加準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)支持。

  三、多重檢測(cè)和微型化也是ELISA檢測(cè)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)之一。多重檢測(cè)能夠同時(shí)檢測(cè)多種抗原或抗體，提高檢測(cè)效率和通量；而微型化則能夠減少樣本和試劑的用量，降低成本，同時(shí)便于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。這些技術(shù)的發(fā)展將使ELISA檢測(cè)更加適應(yīng)復(fù)雜多樣的科研需求。

  四、隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，交叉學(xué)科的研究也越來(lái)越受到重視。未來(lái)，ELISA檢測(cè)將與其他技術(shù)如基因測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)等相結(jié)合，形成多技術(shù)融合的檢測(cè)平臺(tái)，為科研人員提供更加全面、深入的分析手段。

  ELISA是用來(lái)檢測(cè)什么？通過(guò)上述介紹，相信您對(duì)elisa檢測(cè)有所了解。ELISA在科研領(lǐng)域重要性是不言而有的，ELISA在不斷的推動(dòng)生命科學(xué)的發(fā)展，作為科研人員，我們與時(shí)俱進(jìn)，不斷的深入學(xué)習(xí)和掌握ELISA檢測(cè)技術(shù)，推動(dòng)科研進(jìn)步！