ELISA是酶聯(lián)免疫吸附分析的縮寫。在這種實(shí)驗(yàn)方法中，使用免疫吸附劑（與固體表面結(jié)合的抗原或抗體）和酶聯(lián)免疫反應(yīng)物。例如，ELISA用于利用未標(biāo)記的未知物和標(biāo)記的反應(yīng)物之間的競爭性結(jié)合來檢測未知濃度。ELISA不但成為了一種非常簡便的研究工具，而且迅速地應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)及標(biāo)志物的臨床檢測，并在臨床應(yīng)用中逐步取代了放免技術(shù)。下面上海通蔚為大家全面了解ELISA實(shí)驗(yàn)原理、步驟和注意事項(xiàng).
ELISA試劑盒原理
ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定） 是一種將抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來的一種綜合性技術(shù)。其基本原理是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，將待測物質(zhì)與酶標(biāo)記的抗體或抗原結(jié)合，通過酶催化底物顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行定性或定量分析。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合方式，有
直接法、間接法、夾心法、競爭法等。下面詳細(xì)介紹：
直接ELISA
在直接ELISA中，待測抗原被吸附到反應(yīng)板的孔中，并進(jìn)行洗滌去除未結(jié)合的抗原。隨后，添加酶標(biāo)記的抗體，該抗體能夠特異性識別抗原。抗體與抗原結(jié)合后，加入底物溶液，酶催化底物發(fā)生顏色變化，顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。
優(yōu)缺點(diǎn)分析:
1.優(yōu)點(diǎn):
-
操作簡單快速：直接ELISA僅使用一種抗體，步驟較少，減少了誤差的可能性，提高了實(shí)驗(yàn)效率。
-
避免交叉反應(yīng)：直接ELISA不使用第二抗體，因此可以避免第二抗體與其他抗體的交叉反應(yīng)，提高檢測的特異性。
2.缺點(diǎn):
-
抗體標(biāo)記難度：為每種抗原準(zhǔn)備相應(yīng)的標(biāo)記抗體，需要額外的時間和成本。
-
靈敏度較低：由于標(biāo)記抗體的密度較低，直接ELISA的靈敏度可能低于間接ELISA。
在直接ELISA法中，為了提高直接ELISA法的靈敏度，可以嘗試以下幾種方法：
1.使用高親和力的標(biāo)記抗體：
選擇與抗原結(jié)合能力更強(qiáng)的標(biāo)記抗體，可以提高抗原的識別效率，從而提高靈敏度。
可以使用單克隆抗體，因?yàn)閱慰寺】贵w具有更高的特異性和親和力。
2.優(yōu)化標(biāo)記方法：
可以嘗試不同的標(biāo)記方法，例如使用更有效的酶或熒光標(biāo)記物，以提高標(biāo)記效率和靈敏度。
可以嘗試對抗體進(jìn)行優(yōu)化，例如改變抗體的結(jié)構(gòu)或進(jìn)行修飾，以提高其標(biāo)記效率。
3.提高抗原的包被密度：
在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時，可以通過增加抗原的包被濃度或延長包被時間，提高抗原在反應(yīng)板上的吸附密度，從而提高檢測靈敏度。
4.使用信號放大技術(shù)：
可以使用一些信號放大技術(shù)，例如生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，來放大信號，提高檢測靈敏度。
5.使用更靈敏的檢測方法：
可以使用更靈敏的檢測方法，例如化學(xué)發(fā)光檢測法，來提高檢測的靈敏度。
6.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件：
優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，例如調(diào)整孵育時間、洗滌步驟、底物濃度等，可以提高實(shí)驗(yàn)的效率和靈敏度。
7.使用更敏感的試劑盒：
選擇專門為提高靈敏度設(shè)計(jì)的直接ELISA試劑盒，例如使用高靈敏度的酶標(biāo)記抗體或高靈敏度的底物。
間接ELISA
間接ELISA使用兩種抗體：第一抗體（一抗）特異性識別待測抗原，第二抗體（二抗）特異性識別一抗。首先，待測抗原被吸附到反應(yīng)板的孔中，并進(jìn)行洗滌去除未結(jié)合的抗原。然后，加入一抗，一抗與抗原結(jié)合。接著，加入酶標(biāo)記的二抗，二抗與一抗結(jié)合。最后，加入底物溶液，酶催化底物發(fā)生顏色變化，顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。
優(yōu)缺點(diǎn)分析:
1.優(yōu)點(diǎn):
-
降低成本：可以利用同一物種的多種一抗，并使用相同的標(biāo)記二抗進(jìn)行檢測，降低實(shí)驗(yàn)成本和工作量。
-
提高靈敏度：由于一抗未被標(biāo)記，可以保持其天然的免疫活性，提高檢測的靈敏度。此外，高密度的二抗標(biāo)記能夠放大信號，進(jìn)一步提高檢測靈敏度。
2.缺點(diǎn):
-
存在交叉反應(yīng)：二抗可能與其他抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致非特異性信號，降低檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
-
延長實(shí)驗(yàn)時間：間接ELISA需要額外的孵育步驟，增加了實(shí)驗(yàn)時間。
在間接ELISA法中，為了避免存在交叉反應(yīng)，要注意：
1、選擇高純度的二抗：高純度的二抗可以降低雜質(zhì)抗體存在的可能性。
2、選擇對一抗具有高度特異性的二抗：這樣可以確保二抗只與一抗結(jié)合，而不會與其他抗體結(jié)合。
3、進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)：在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時，需要設(shè)置對照組，排除二抗的交叉反應(yīng)造成的假陽性結(jié)果。
夾心ELISA
夾心ELISA需要使用兩對抗體，分別識別抗原的不同表位，而且這兩個表位不能重疊。首先，將捕獲抗體固定在反應(yīng)板的孔中。然后，加入待測樣本，如果樣本中含有待測抗原，抗原就會與捕獲抗體結(jié)合。接著，加入酶標(biāo)記的檢測抗體，它能夠識別與捕獲抗體結(jié)合的抗原。最后，加入底物溶液，酶催化底物發(fā)生顏色變化，顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。
優(yōu)缺點(diǎn)分析:
1.優(yōu)點(diǎn):
-
高特異性：由于使用兩種針對同一抗原不同表位的抗體，夾心ELISA具有很高的特異性，可以有效地識別并檢測目標(biāo)抗原。
-
適用范圍廣：夾心ELISA適用于復(fù)雜或粗/不純的樣品，無需對抗原進(jìn)行預(yù)處理，可以直接進(jìn)行檢測。
-
靈敏度高：夾心ELISA的靈敏度較高，可以檢測微量的抗原。
2.缺點(diǎn):
-
需要定制開發(fā)抗體：如果市面上沒有現(xiàn)成的配對抗體，就需要定制開發(fā)，這會增加時間和成本。
競爭ELISA
競爭性ELISA是一種用于測量樣本中抗原或抗體濃度的免疫學(xué)檢測方法，特別適用于檢測小分子抗原或抗體。它的原理是：將待測樣本中的抗原或抗體與已知濃度的標(biāo)記抗原或抗體（參考物質(zhì)）進(jìn)行競爭性結(jié)合，競爭結(jié)合到固相載體上的抗體或抗原。樣本中的抗原或抗體濃度越高，與標(biāo)記參考物質(zhì)競爭結(jié)合的量就越少，最終產(chǎn)生的信號強(qiáng)度就越弱。
優(yōu)缺點(diǎn)分析:
競爭性ELISA可以基于直接ELISA、間接ELISA或夾心ELISA的檢測方法，因此其優(yōu)缺點(diǎn)也與所選用的檢測方法有關(guān)。
1.優(yōu)點(diǎn):
-
高靈敏度：可以檢測微量的抗原或抗體。
-
適用于小分子抗原或抗體：可以檢測無法直接捕獲或檢測的小分子抗原或抗體。
2.缺點(diǎn):
-
操作復(fù)雜：需要額外的步驟來進(jìn)行競爭性結(jié)合反應(yīng)。
-
需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制：需要確保參考物質(zhì)的濃度和質(zhì)量穩(wěn)定。
ELISA優(yōu)缺點(diǎn)
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)由EvaEngvall和PeterPerlmann于1971年首次描述，是一種廣泛使用的分析生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)。與其他免疫測定程序相比，ELISA具有許多優(yōu)點(diǎn)：
1、由于其出色的敏感性和特異性而被經(jīng)常使用。
2、與放射免疫分析(RIA)測試等其他程序相比，ELISA的準(zhǔn)確性更高。
3、最常見的ELISA檢測形式是96孔微孔板。大多數(shù)ELISA微孔板都有分開的孔，必要時可以進(jìn)行小規(guī)模的檢測。主要優(yōu)點(diǎn)是一次檢測可以進(jìn)行96次測定，結(jié)果通常在3小時內(nèi)即可得出。這是一種省時且經(jīng)濟(jì)的方法。
4、ELISA不需要使用放射性同位素或昂貴的輻射計(jì)數(shù)器。只需要精確的微量移液器、培養(yǎng)箱、清洗系統(tǒng)和微孔板分光光度計(jì)讀數(shù)器。
ELISA缺點(diǎn)：
ELISA中對免疫原性抗原的抑制不足會導(dǎo)致錯誤結(jié)果。
由于抗體是蛋白質(zhì)，因此必須冷藏運(yùn)輸和儲存。
ELISA制備抗體需要大量時間且成本高昂。
其中出現(xiàn)假陽性和假陰性的概率很高。
ELISA抗體存在不穩(wěn)定性。
ELISA實(shí)驗(yàn)步驟
一、
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
1.試劑準(zhǔn)備：
IL-1βELISA試劑盒（包含：包被抗體、檢測抗體、酶結(jié)合物、標(biāo)準(zhǔn)品、底物溶液、終止液、洗滌液等）
PBS緩沖液(pH7.4)
蒸餾水
微量移液器
吸頭
酶標(biāo)板
酶標(biāo)儀
孵育箱
洗板機(jī)(可選)
離心機(jī)(可選)
2.樣本準(zhǔn)備：
采集需要檢測IL-1β的樣本，例如血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。
按照試劑盒說明書的要求處理樣本，例如離心去除細(xì)胞碎片、稀釋等。
準(zhǔn)備好空白對照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。
3.實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備：
準(zhǔn)備合適的酶標(biāo)板，通常為96孔板。
準(zhǔn)備移液器、吸頭、孵育箱、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)器材。
二、
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.包被：
將試劑盒中的包被抗體(捕捉抗體)稀釋至合適的濃度，并按照說明書的要求加入到酶標(biāo)板孔中。
將酶標(biāo)板置于4℃冰箱過夜或37℃孵育2小時，使抗體牢固地吸附在酶標(biāo)板上。
用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，去除未結(jié)合的抗體。
2.封閉：
將試劑盒中的封閉液加入到酶標(biāo)板孔中，并按照說明書的要求進(jìn)行孵育(通常為37℃1小時)。
封閉液可以阻止酶標(biāo)板表面非特異性結(jié)合，減少實(shí)驗(yàn)誤差。
用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，去除未結(jié)合的封閉液。
3.加樣：
加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照(空白對照通常只加入緩沖液，不加樣本)到酶標(biāo)板孔中，每個孔的體積通常為100μL。
按照說明書的要求進(jìn)行孵育(通常為37℃1小時)。
4.洗滌：
用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，去除未結(jié)合的物質(zhì)。
5.加入酶結(jié)合物：
將試劑盒中的酶結(jié)合物(通常為酶標(biāo)記的檢測抗體)稀釋至合適的濃度，并加入到酶標(biāo)板孔中。
按照說明書的要求進(jìn)行孵育(通常為37℃1小時)。
6.洗滌：
用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物。
7.加入底物溶液：
將試劑盒中的底物溶液加入到酶標(biāo)板孔中，并按照說明書的要求進(jìn)行反應(yīng)(通常為室溫避光孵育15-30分鐘)。
酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化。
8.終止反應(yīng)：
加入終止液(通常為酸性溶液)，終止顯色反應(yīng)，防止顏色繼續(xù)加深。
9.比色：
用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值，并按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，最終計(jì)算出樣本中IL-1β的濃度。
10.’注意事項(xiàng)：
嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，不同的試劑盒可能會有不同的操作步驟和參數(shù)。
確保所有試劑和器材處于最佳狀態(tài)，例如試劑的有效期、酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)等。
注意實(shí)驗(yàn)環(huán)境，例如溫度、濕度、光照等因素會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
做好實(shí)驗(yàn)記錄，包括實(shí)驗(yàn)日期、試劑批號、樣本信息、操作步驟、結(jié)果等，便于日后分析和追溯。
注意實(shí)驗(yàn)室安全，例如戴手套、穿實(shí)驗(yàn)服、操作規(guī)范等。
上述為大家介紹ELISA實(shí)驗(yàn)原理及步驟，通過原理和步驟對ELISA有初步的認(rèn)識。除此之外，在實(shí)驗(yàn)中多加實(shí)踐，有助于提高實(shí)驗(yàn)效果。上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司擁有15年以上的ELISA試劑盒生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，搭建了ELISA試劑盒開發(fā)和成熟抗原-抗體系統(tǒng)的良好平臺?？商峁?000多種ELISA試劑盒，主要采用夾心法和競爭法，覆蓋3000個靶標(biāo)，涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個種類。如需試劑盒，歡迎前來咨詢！
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