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ELISA實(shí)驗(yàn)原理及步驟:從入門到精通

發(fā)布時(shí)間:2024-06-25     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  ELISA是酶聯(lián)免疫吸附分析的縮寫。在這種實(shí)驗(yàn)方法中,使用免疫吸附劑(與固體表面結(jié)合的抗原或抗體)和酶聯(lián)免疫反應(yīng)物。例如,ELISA用于利用未標(biāo)記的未知物和標(biāo)記的反應(yīng)物之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)檢測(cè)未知濃度。ELISA不但成為了一種非常簡(jiǎn)便的研究工具,而且迅速地應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)及標(biāo)志物的臨床檢測(cè),并在臨床應(yīng)用中逐步取代了放免技術(shù)。下面上海通蔚為大家全面了解ELISA實(shí)驗(yàn)原理、步驟和注意事項(xiàng).

  ELISA試劑盒原理


  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定) 是一種將抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種綜合性技術(shù)。其基本原理是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性,將待測(cè)物質(zhì)與酶標(biāo)記的抗體或抗原結(jié)合,通過(guò)酶催化底物顯色反應(yīng),根據(jù)顏色深淺進(jìn)行定性或定量分析。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合方式,有直接法、間接法、夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等。下面詳細(xì)介紹:

  直接ELISA


  在直接ELISA中,待測(cè)抗原被吸附到反應(yīng)板的孔中,并進(jìn)行洗滌去除未結(jié)合的抗原。隨后,添加酶標(biāo)記的抗體,該抗體能夠特異性識(shí)別抗原??贵w與抗原結(jié)合后,加入底物溶液,酶催化底物發(fā)生顏色變化,顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。

  

  優(yōu)缺點(diǎn)分析:

  1.優(yōu)點(diǎn):
  • 操作簡(jiǎn)單快速:直接ELISA僅使用一種抗體,步驟較少,減少了誤差的可能性,提高了實(shí)驗(yàn)效率。
  • 避免交叉反應(yīng):直接ELISA不使用第二抗體,因此可以避免第二抗體與其他抗體的交叉反應(yīng),提高檢測(cè)的特異性。


  2.缺點(diǎn):
  • 抗體標(biāo)記難度:為每種抗原準(zhǔn)備相應(yīng)的標(biāo)記抗體,需要額外的時(shí)間和成本。
  • 靈敏度較低:由于標(biāo)記抗體的密度較低,直接ELISA的靈敏度可能低于間接ELISA。


  在直接ELISA法中,為了提高直接ELISA法的靈敏度,可以嘗試以下幾種方法:

  1.使用高親和力的標(biāo)記抗體:

  選擇與抗原結(jié)合能力更強(qiáng)的標(biāo)記抗體,可以提高抗原的識(shí)別效率,從而提高靈敏度。

  可以使用單克隆抗體,因?yàn)閱慰寺】贵w具有更高的特異性和親和力。

  2.優(yōu)化標(biāo)記方法:

  可以嘗試不同的標(biāo)記方法,例如使用更有效的酶或熒光標(biāo)記物,以提高標(biāo)記效率和靈敏度。

  可以嘗試對(duì)抗體進(jìn)行優(yōu)化,例如改變抗體的結(jié)構(gòu)或進(jìn)行修飾,以提高其標(biāo)記效率。

  3.提高抗原的包被密度:

  在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí),可以通過(guò)增加抗原的包被濃度或延長(zhǎng)包被時(shí)間,提高抗原在反應(yīng)板上的吸附密度,從而提高檢測(cè)靈敏度。

  4.使用信號(hào)放大技術(shù):

  可以使用一些信號(hào)放大技術(shù),例如生物素-鏈霉親和素系統(tǒng),來(lái)放大信號(hào),提高檢測(cè)靈敏度。

  5.使用更靈敏的檢測(cè)方法:

  可以使用更靈敏的檢測(cè)方法,例如化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法,來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度。

  6.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件:

  優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,例如調(diào)整孵育時(shí)間、洗滌步驟、底物濃度等,可以提高實(shí)驗(yàn)的效率和靈敏度。

  7.使用更敏感的試劑盒:

  選擇專門為提高靈敏度設(shè)計(jì)的直接ELISA試劑盒,例如使用高靈敏度的酶標(biāo)記抗體或高靈敏度的底物。

  間接ELISA


  間接ELISA使用兩種抗體:第一抗體(一抗)特異性識(shí)別待測(cè)抗原,第二抗體(二抗)特異性識(shí)別一抗。首先,待測(cè)抗原被吸附到反應(yīng)板的孔中,并進(jìn)行洗滌去除未結(jié)合的抗原。然后,加入一抗,一抗與抗原結(jié)合。接著,加入酶標(biāo)記的二抗,二抗與一抗結(jié)合。最后,加入底物溶液,酶催化底物發(fā)生顏色變化,顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。

  

  優(yōu)缺點(diǎn)分析:

  1.優(yōu)點(diǎn):
  • 降低成本:可以利用同一物種的多種一抗,并使用相同的標(biāo)記二抗進(jìn)行檢測(cè),降低實(shí)驗(yàn)成本和工作量。
  • 提高靈敏度:由于一抗未被標(biāo)記,可以保持其天然的免疫活性,提高檢測(cè)的靈敏度。此外,高密度的二抗標(biāo)記能夠放大信號(hào),進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。
  2.缺點(diǎn):
  • 存在交叉反應(yīng):二抗可能與其他抗體發(fā)生交叉反應(yīng),導(dǎo)致非特異性信號(hào),降低檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
  • 延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間:間接ELISA需要額外的孵育步驟,增加了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

  在間接ELISA法中,為了避免存在交叉反應(yīng),要注意:

  1、選擇高純度的二抗:高純度的二抗可以降低雜質(zhì)抗體存在的可能性。

  2、選擇對(duì)一抗具有高度特異性的二抗:這樣可以確保二抗只與一抗結(jié)合,而不會(huì)與其他抗體結(jié)合。

  3、進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn):在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí),需要設(shè)置對(duì)照組,排除二抗的交叉反應(yīng)造成的假陽(yáng)性結(jié)果。

  夾心ELISA


  夾心ELISA需要使用兩對(duì)抗體,分別識(shí)別抗原的不同表位,而且這兩個(gè)表位不能重疊。首先,將捕獲抗體固定在反應(yīng)板的孔中。然后,加入待測(cè)樣本,如果樣本中含有待測(cè)抗原,抗原就會(huì)與捕獲抗體結(jié)合。接著,加入酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體,它能夠識(shí)別與捕獲抗體結(jié)合的抗原。最后,加入底物溶液,酶催化底物發(fā)生顏色變化,顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。

  

  優(yōu)缺點(diǎn)分析:

  1.優(yōu)點(diǎn):
  • 高特異性:由于使用兩種針對(duì)同一抗原不同表位的抗體,夾心ELISA具有很高的特異性,可以有效地識(shí)別并檢測(cè)目標(biāo)抗原。
  • 適用范圍廣:夾心ELISA適用于復(fù)雜或粗/不純的樣品,無(wú)需對(duì)抗原進(jìn)行預(yù)處理,可以直接進(jìn)行檢測(cè)。
  • 靈敏度高:夾心ELISA的靈敏度較高,可以檢測(cè)微量的抗原。

  2.缺點(diǎn):
  • 需要定制開發(fā)抗體:如果市面上沒有現(xiàn)成的配對(duì)抗體,就需要定制開發(fā),這會(huì)增加時(shí)間和成本。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA


  競(jìng)爭(zhēng)性ELISA是一種用于測(cè)量樣本中抗原或抗體濃度的免疫學(xué)檢測(cè)方法,特別適用于檢測(cè)小分子抗原或抗體。它的原理是:將待測(cè)樣本中的抗原或抗體與已知濃度的標(biāo)記抗原或抗體(參考物質(zhì))進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到固相載體上的抗體或抗原。樣本中的抗原或抗體濃度越高,與標(biāo)記參考物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的量就越少,最終產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度就越弱。

  優(yōu)缺點(diǎn)分析:

  競(jìng)爭(zhēng)性ELISA可以基于直接ELISA、間接ELISA或夾心ELISA的檢測(cè)方法,因此其優(yōu)缺點(diǎn)也與所選用的檢測(cè)方法有關(guān)。

  1.優(yōu)點(diǎn):
  • 高靈敏度:可以檢測(cè)微量的抗原或抗體。
  • 適用于小分子抗原或抗體:可以檢測(cè)無(wú)法直接捕獲或檢測(cè)的小分子抗原或抗體。

  2.缺點(diǎn):

  • 操作復(fù)雜:需要額外的步驟來(lái)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)。
  • 需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制:需要確保參考物質(zhì)的濃度和質(zhì)量穩(wěn)定。

  ELISA優(yōu)缺點(diǎn)


  酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)由EvaEngvall和PeterPerlmann于1971年首次描述,是一種廣泛使用的分析生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)。與其他免疫測(cè)定程序相比,ELISA具有許多優(yōu)點(diǎn):

  1、由于其出色的敏感性和特異性而被經(jīng)常使用。

  2、與放射免疫分析(RIA)測(cè)試等其他程序相比,ELISA的準(zhǔn)確性更高。

  3、最常見的ELISA檢測(cè)形式是96孔微孔板。大多數(shù)ELISA微孔板都有分開的孔,必要時(shí)可以進(jìn)行小規(guī)模的檢測(cè)。主要優(yōu)點(diǎn)是一次檢測(cè)可以進(jìn)行96次測(cè)定,結(jié)果通常在3小時(shí)內(nèi)即可得出。這是一種省時(shí)且經(jīng)濟(jì)的方法。

  4、ELISA不需要使用放射性同位素或昂貴的輻射計(jì)數(shù)器。只需要精確的微量移液器、培養(yǎng)箱、清洗系統(tǒng)和微孔板分光光度計(jì)讀數(shù)器。

  ELISA缺點(diǎn)

  ELISA中對(duì)免疫原性抗原的抑制不足會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。

  由于抗體是蛋白質(zhì),因此必須冷藏運(yùn)輸和儲(chǔ)存。

  ELISA制備抗體需要大量時(shí)間且成本高昂。

  其中出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的概率很高。

  ELISA抗體存在不穩(wěn)定性。

  ELISA實(shí)驗(yàn)步驟


  一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

  1.試劑準(zhǔn)備:

  IL-1βELISA試劑盒(包含:包被抗體、檢測(cè)抗體、酶結(jié)合物、標(biāo)準(zhǔn)品、底物溶液、終止液、洗滌液等)

  PBS緩沖液(pH7.4)

  蒸餾水

  微量移液器

  吸頭

  酶標(biāo)板

  酶標(biāo)儀

  孵育箱

  洗板機(jī)(可選)

  離心機(jī)(可選)

  2.樣本準(zhǔn)備:

  采集需要檢測(cè)IL-1β的樣本,例如血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。

  按照試劑盒說(shuō)明書的要求處理樣本,例如離心去除細(xì)胞碎片、稀釋等。

  準(zhǔn)備好空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。

  3.實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備:

  準(zhǔn)備合適的酶標(biāo)板,通常為96孔板。

  準(zhǔn)備移液器、吸頭、孵育箱、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)器材。

  二、實(shí)驗(yàn)步驟

  1.包被:

  將試劑盒中的包被抗體(捕捉抗體)稀釋至合適的濃度,并按照說(shuō)明書的要求加入到酶標(biāo)板孔中。

  將酶標(biāo)板置于4℃冰箱過(guò)夜或37℃孵育2小時(shí),使抗體牢固地吸附在酶標(biāo)板上。

  用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次,去除未結(jié)合的抗體。

  2.封閉:

  將試劑盒中的封閉液加入到酶標(biāo)板孔中,并按照說(shuō)明書的要求進(jìn)行孵育(通常為37℃1小時(shí))。

  封閉液可以阻止酶標(biāo)板表面非特異性結(jié)合,減少實(shí)驗(yàn)誤差。

  用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次,去除未結(jié)合的封閉液。

  3.加樣:

  加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照(空白對(duì)照通常只加入緩沖液,不加樣本)到酶標(biāo)板孔中,每個(gè)孔的體積通常為100μL。

  按照說(shuō)明書的要求進(jìn)行孵育(通常為37℃1小時(shí))。

  4.洗滌:

  用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次,去除未結(jié)合的物質(zhì)。

  5.加入酶結(jié)合物:

  將試劑盒中的酶結(jié)合物(通常為酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體)稀釋至合適的濃度,并加入到酶標(biāo)板孔中。

  按照說(shuō)明書的要求進(jìn)行孵育(通常為37℃1小時(shí))。

  6.洗滌:

  用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物。

  7.加入底物溶液:

  將試劑盒中的底物溶液加入到酶標(biāo)板孔中,并按照說(shuō)明書的要求進(jìn)行反應(yīng)(通常為室溫避光孵育15-30分鐘)。

  酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng),產(chǎn)生顏色變化。

  8.終止反應(yīng):

  加入終止液(通常為酸性溶液),終止顯色反應(yīng),防止顏色繼續(xù)加深。

  9.比色:

  用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光度值,并按照試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,最終計(jì)算出樣本中IL-1β的濃度。

  10.’注意事項(xiàng):

  嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,不同的試劑盒可能會(huì)有不同的操作步驟和參數(shù)。

  確保所有試劑和器材處于最佳狀態(tài),例如試劑的有效期、酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)等。

  注意實(shí)驗(yàn)環(huán)境,例如溫度、濕度、光照等因素會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

  做好實(shí)驗(yàn)記錄,包括實(shí)驗(yàn)日期、試劑批號(hào)、樣本信息、操作步驟、結(jié)果等,便于日后分析和追溯。

  注意實(shí)驗(yàn)室安全,例如戴手套、穿實(shí)驗(yàn)服、操作規(guī)范等。

  上述為大家介紹ELISA實(shí)驗(yàn)原理及步驟,通過(guò)原理和步驟對(duì)ELISA有初步的認(rèn)識(shí)。除此之外,在實(shí)驗(yàn)中多加實(shí)踐,有助于提高實(shí)驗(yàn)效果。上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司擁有15年以上的ELISA試劑盒生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn),搭建了ELISA試劑盒開發(fā)和成熟抗原-抗體系統(tǒng)的良好平臺(tái)??商峁?000多種ELISA試劑盒,主要采用夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法,覆蓋3000個(gè)靶標(biāo),涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個(gè)種類。如需試劑盒,歡迎前來(lái)咨詢!