二抗選擇：提高實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵

  在免疫學(xué)實驗中，通常會用到二抗，二抗通過與一抗結(jié)合，進(jìn)而與靶抗原結(jié)合，促進(jìn)靶分子的間接檢測。二抗在免疫學(xué)實驗中起著舉足輕重的作用，二抗的選擇也決定整個實驗的成敗。了解一抗和二抗可以參考這篇文章《一抗和二抗簡介》

圖 1.直接與間接免疫測定

  二抗間接檢測優(yōu)勢

  提高靈敏度——多個二抗與單個一抗結(jié)合會導(dǎo)致信號放大。

  靈活性——通過與多個一抗配對，相同的二抗可以用于檢測多個目標(biāo)。

  用途更廣泛——根據(jù)預(yù)期應(yīng)用，相同的一抗可以與各種二抗配對（例如，用于蛋白質(zhì)印跡的HRP結(jié)合物和用于IF/FC的熒光結(jié)合物）。

  容易獲得——針對大多數(shù)物種的二抗可從多個商業(yè)供應(yīng)商處以多種結(jié)合物選擇廣泛獲得。

  選擇二抗

  在應(yīng)用中選擇合適的二抗取決于多種因素（如下所述），以確保高度靈敏和準(zhǔn)確地檢測目標(biāo)抗原。

  1.靶標(biāo)特異性–二抗必須針對一抗的宿主物種產(chǎn)生。例如，如果一抗是在小鼠中產(chǎn)生的，則二抗必須是抗小鼠的，并且在小鼠以外的宿主物種中產(chǎn)生（例如，山羊抗小鼠二抗）。此外，二抗應(yīng)該對一抗類或亞類具有特異性。由于大多數(shù)多克隆一抗是針對同種型IgG產(chǎn)生的，因此使用的二抗應(yīng)該識別IgG重鏈和輕鏈（抗IgGH+L）。另一方面，單克隆一抗是針對特定IgG亞類產(chǎn)生的，因此需要亞類特異性二抗來檢測它們。

  2.克隆性——傳統(tǒng)上，抗體被分為多克隆抗體和單克隆抗體。多克隆二抗是識別同一抗原上不同表位的異質(zhì)抗體群，而單克隆二抗是識別抗原上相同表位的同質(zhì)抗體群。在決定抗體克隆性時，選擇取決于預(yù)期應(yīng)用的更重要因素——特異性或靈敏度。雖然單克隆二抗比多克隆抗體具有更好的特異性，并且是需要高度特異性靶標(biāo)檢測的應(yīng)用的首選（例如，用于檢測特定的小鼠同種型），但多克隆二抗比單克隆二抗靈敏得多，因此用于需要高靈敏度的應(yīng)用（例如，用于檢測低豐度靶標(biāo)）。

  3.宿主物種–宿主物種是指生產(chǎn)二抗的動物。確保二抗宿主與生產(chǎn)一抗的宿主動物不同非常重要。雖然大多數(shù)一抗是在兔子或老鼠體內(nèi)生產(chǎn)的，但山羊是市售二抗最廣泛使用的宿主動物。

  進(jìn)行多重實驗時，雖然建議所有一抗均來自同一宿主物種，但使用的二抗應(yīng)在同一宿主物種中產(chǎn)生。這有助于防止二抗與非目標(biāo)物種的一抗之間發(fā)生交叉反應(yīng)。

  4.抗體形式——二抗有多種形式，包括完整抗體和抗體片段。二抗形式的選擇取決于抗體的預(yù)期應(yīng)用。例如，對于組織樣本中的IHC和IF，包括F(ab')2和Fab'的抗體片段比完整抗體更受歡迎，因為它們的尺寸更小，可以更好地穿透組織。此外，由于片段二抗缺乏Fc區(qū)，它們有助于消除Fc區(qū)與某些細(xì)胞類型（B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）上的Fc受體非特異性結(jié)合導(dǎo)致的高背景，從而使它們非常適合用于富含F(xiàn)c受體的樣本。然而，需要記住的一點是，片段抗體的靈敏度低于完整抗體，因為它們的尺寸較小，可以結(jié)合更少的染料或酶分子。

  5.結(jié)合物類型——二抗結(jié)合物的選擇主要取決于兩個因素：(i)二抗的應(yīng)用，以及(ii)該應(yīng)用中使用的檢測方法。例如，在進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實驗時，雖然HRP標(biāo)記的二抗用于化學(xué)發(fā)光檢測，但建議使用熒光染料標(biāo)記的二抗進(jìn)行熒光檢測。下表根據(jù)預(yù)期應(yīng)用和檢測方法重點介紹了建議的二抗結(jié)合物。

應(yīng)用	二抗偶聯(lián)物
蛋白質(zhì)印跡	酶標(biāo)記二抗，例如用于化學(xué)發(fā)光檢測的 HRP 和用于比色檢測的 AP 熒光標(biāo)記的二抗可用于熒光檢測
免疫組織化學(xué)	用于顯色 IHC 的酶標(biāo)記二抗（例如 HRP 或 HRP 聚合物） 用于信號放大的生物素化二抗 用于熒光 IHC 的熒光標(biāo)記二抗
免疫熒光	熒光標(biāo)記的二抗 HRP 標(biāo)記的二抗可用于基于 TSA 的檢測
流式細(xì)胞	熒光標(biāo)記的二抗 酶標(biāo)記的二抗 生物素化的二抗可與熒光標(biāo)記的鏈霉親和素一起使用
酶聯(lián)免疫吸附試驗	生物素標(biāo)記的二抗 酶標(biāo)記的二抗

  6.交叉吸附抗體——交叉吸附二抗是傳統(tǒng)的多克隆二抗，經(jīng)過額外的純化步驟以消除與非目標(biāo)物種的非預(yù)期IgG的交叉反應(yīng)。當(dāng)二抗與樣品中的內(nèi)源性免疫球蛋白結(jié)合或在多路復(fù)用應(yīng)用中與脫靶抗體結(jié)合時，交叉反應(yīng)可能導(dǎo)致高背景或非特異性信號。交叉吸附通過將親和純化的多克隆二抗通過含有固定化抗體或其他物種血清蛋白的柱子來幫助提高抗體特異性。這有助于捕獲柱中的非特異性抗體，同時允許在流過液中收集沒有交叉反應(yīng)的抗體。

  好了，上述為大家介紹了二抗的選擇。如果你在免疫學(xué)實驗中經(jīng)常出現(xiàn)無法識別目標(biāo)抗體、產(chǎn)生假陽性結(jié)果、降低實驗靈敏度等因素，要留意歐聯(lián)二抗是否選對。當(dāng)然，你可以結(jié)合文章介紹對應(yīng)判斷，文章給大家一個參考。這里，通蔚也祝福您在免疫學(xué)實驗中提高實驗的成功率。