聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：數(shù)字 PCR

  數(shù)字PCR(dPCR)是繼終點PCR和實時定量PCR(RT-qPCR)之后的第三代PCR。數(shù)字PCR具有高靈敏度、準(zhǔn)確性和絕對量化樣本中目標(biāo)DNA量的能力。這種高靈敏度可以檢測罕見突變、拷貝數(shù)變異(CNV)、低豐度轉(zhuǎn)錄本、罕見microRNA和極低病毒載量。

  什么是數(shù)字PCR（dPCR）

  數(shù)字PCR的概念最早由Sykes等人于1992年提出，他們認(rèn)識到，極限稀釋、終點PCR和泊松統(tǒng)計的組合可以產(chǎn)生核酸濃度的絕對測量值（Sykes等人，1992年）。隨后，約翰霍普金斯大學(xué)的Vogelstein和Kinzler開發(fā)了一種方法，將樣本稀釋并分配到可以單獨擴增單個模板分子的程度，每個分子都在單獨的分區(qū)中，并使用熒光探針檢測產(chǎn)物（Vogelstein和Kinzler，1999年）?！皵?shù)字PCR”一詞就是為描述這種新方法而創(chuàng)造的。

  dPCR與標(biāo)準(zhǔn)終點PCR的不同之處在于，樣本首先被隨機分成20,0000個子反應(yīng)，而不是在批量樣本上作為單個反應(yīng)運行。PCR反應(yīng)在每個分區(qū)上進行，可以是單個液滴，也可以是在微流體芯片上。理想情況下，每個分區(qū)將包含一個或零個目標(biāo)序列。為了補償包含多個目標(biāo)序列的少數(shù)分區(qū)，數(shù)據(jù)通過泊松統(tǒng)計處理。如果分區(qū)包含可擴增序列，則將其計為陽性（否則將其計為陰性）。

  假設(shè)每個分區(qū)只有一個目標(biāo)，則可以通過計算陽性數(shù)并根據(jù)分區(qū)數(shù)和稀釋因子進行推斷來絕對量化原始樣本中有多少個目標(biāo)。由于計算了實際目標(biāo)數(shù)，因此不需要校準(zhǔn)曲線，但建議對已知樣本和數(shù)量進行控制，以幫助驗證數(shù)據(jù)，尤其是為了發(fā)表。

  dPCR是如何工作

  1.樣品制備

  與任何基因組分析一樣，良好的樣品制備至關(guān)重要。dPCR可用于擴增任何純化的DNA樣品（gDNA或cDNA），但與qPCR一樣，無法直接擴增RNA。因此，在dPCR分析之前，必須分離任何感興趣的mRNA靶標(biāo)并將其轉(zhuǎn)化為cDNA。

  然后將純化的gDNA或cDNA與正向和反向引物以及水解探針混合，每個引物都設(shè)計為具有與目標(biāo)基因/目標(biāo)DNA互補的序列。與傳統(tǒng)PCR一樣，引物退火到目標(biāo)序列的3'和5'端（通常長度為60-150bps）。此外，與傳統(tǒng)PCR不同的是，5'核酸酶（水解）探針隨后在正向和反向引物之間退火，并包括5'熒光團和3'猝滅劑。水解探針增加了反應(yīng)的靈敏度。與所有PCR和qPCR一樣，引物和探針設(shè)計是獲得良好數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。

  2.稀釋和分配

  在樣品制備和添加引物和主混合物后，dPCR檢測將樣品混合物分成單獨的納升反應(yīng)，因此每個分區(qū)中有1個或0個目標(biāo)DNA分子。一些dPCR平臺將混合物分成單獨的微模塑料孔，而其他dPCR平臺將納升大小的反應(yīng)液滴創(chuàng)建為油/水乳液。然后，dPCR分析大約20,000個單獨的qPCR反應(yīng)。

  3.PCR擴增和終點分析

  分割后，使用常規(guī)PCR循環(huán)參數(shù)擴增反應(yīng)。隨著DNA聚合酶從正向引物延伸，其核酸外切酶活性會降解探針，從3′猝滅劑中釋放出5′熒光團，進而發(fā)出可檢測的熒光。如果檢測包括插入染料而不是水解探針，則熒光會隨著雙鏈PCR擴增子的積累而增加。

  PCR循環(huán)完成后，任何包含一個模板或目標(biāo)DNA序列的分區(qū)都會發(fā)出熒光。帶有熒光的液滴或孔的總數(shù)代表樣品中的目標(biāo)分子總數(shù)。實驗完成后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)工具分析數(shù)據(jù)。

  數(shù)字PCR的應(yīng)用

  ddPCR系統(tǒng)中的樣本分割可實現(xiàn)單個模板分子的靈敏、特異性檢測和精確定量，同時減輕靶標(biāo)競爭的影響，使PCR擴增對抑制的敏感性降低，并大大提高僅相差一個核苷酸的檢測的鑒別能力。與其他PCR方法相比，數(shù)字PCR具有顯著優(yōu)勢：絕對定量和大大增強的靈敏度和動態(tài)范圍。由于其高靈敏度、精確度和絕對定量，數(shù)字PCR在許多應(yīng)用中將核酸分析的范圍擴展到其他方法無法企及的范圍：

•   液體活檢
•   拷貝數(shù)變異(CNV)
•   稀有序列檢測
•   基因表達(dá)和miRNA分析
•   單細(xì)胞分析
•   細(xì)胞和基因治療中的污染物檢測
•   病原體檢測
•   下一代測序(NGS)文庫分析